曾全, 陳志宏, 王戌勃, 肖銀波, 楊遠亮

1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；

2. 四川雪寶頂國家級自然保護區(qū)管理局，四川 綿陽 622550；

3. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224

介殼蟲是一類重要的農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟害蟲，具有蟲體小、鑒定和防治難度大等特點。該類群包含多個科屬的種類，僅《中國動物志》第二十二卷蚧總科記錄，在我國分布的種類就達7科330余種[1]。介殼蟲主要吸食植物汁液，造成受害植物長勢衰弱，使得生長緩慢或停止，嚴重時可造成植株成片死亡。川北是指以。川北地區(qū)核桃種植面積廣，其中僅廣元市核桃基地面積就已超過13萬hm2，核桃介殼蟲在川北地區(qū)存在一定的擴散風(fēng)險。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該蟲在廣元、巴中、南充為中心的四川北部地區(qū)為害較為嚴重省內(nèi)未見相關(guān)核桃介殼蟲危害的研究，為指導(dǎo)林間科學(xué)防治，有必要開展該地區(qū)核桃介殼蟲相關(guān)生物學(xué)特性研究。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于四川省廣元市朝天區(qū)中東部中子鎮(zhèn)和曾家鎮(zhèn)，E：105°58′53″～106°10′27″，N：32°32′60″～32°44′55″，海拔范圍 643 m～1 493 m，中子核桃品種園平均海拔790 m，曾家鎮(zhèn)中柏村平均海拔1 255 m。朝天區(qū)年均氣溫15.0 ℃左右，一月均溫4.7 ℃，七月均溫25.9 ℃；曾家片區(qū)中山巖溶臺地年均氣溫12.0 ℃，一月均溫1.6 ℃，七月均溫19.9 ℃。海拔900 m以下的河谷階地多為新積土；海拔900～1 500 m之間為黃壤土類；海拔1 500 m以上為黃棕壤土類。中子核桃品種園有川早、南福1號、冕漾、巴山烏米仔和白龍1號等20多個品種，樹齡10～30年，樹高2～7 m，生長發(fā)育良好。曾家鎮(zhèn)中柏村主要種植品種為川早、烏米仔，品種相對單一，樹齡15～30年，樹高5～7 m，部分樹勢受到介殼蟲影響嚴重。

2 研究方法

2.1 主要材料

從中子核桃品種園、曾家鎮(zhèn)中柏村核桃樹枝干上采集介殼蟲，樣品采集時分別用75%乙醇和無水乙醇（分析純）保存。75%乙醇保存的樣品用于玻片標(biāo)本制作，以便進行形態(tài)學(xué)鑒定；無水乙醇保存的樣品用于DNA提取、擴增和測序。

形態(tài)學(xué)鑒定試劑：解剖針、凹面皿、解剖鏡、梯度酒精、10%NaOH、品紅、苯酚、二甲苯、樹脂、光學(xué)顯微鏡（尼康N100）。

分子生物學(xué)鑒定試劑：PCR管、離心管（1.5 mL）、槍頭、移液槍（Eppendorf）、低溫高速離心機（MR22）、分析天平（BSA124S）、微波爐（Galanz）、電泳儀（DYY-6D型）、PCR儀（BIO-RADS1000）、凝膠成像系統(tǒng)（GeIDoc-It2Imager）、DNA提取試劑盒（DNeasy Blood & Tissue Kit）。

2.2 研究方法

選取介殼蟲成蟲，去除乙醇和雜質(zhì)。用昆蟲針刺破表皮，取其體液做分子鑒定，表皮留作形態(tài)學(xué)鑒定。

2.2.1 介殼蟲形態(tài)鑒定

采用上海昆蟲博物館的玻片制作程序[2]，使用中國盾蚧志[3-5]分類檢索表在復(fù)式光學(xué)顯微鏡下檢視憑證標(biāo)本。通過制作玻片標(biāo)本，使用光學(xué)顯微鏡對觸角、背腺管、前氣門、臀板和臀葉等部位的形態(tài)特征進行觀察。

2.2.2 DNA 提取，PCR 擴增和測序

采用試劑盒的方法提取DNA。選用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒，按照使用手冊的步驟提取盾蚧的總基因組DNA。獲取的DNA模板置于-20 ℃保存。COⅠ的PCR擴增選用30 μL體系：3 μL DNA 模板，上下游引物各 10 pmol，10 μL ddH2O 和 15 μL Premix Taq (LA Taq Version 2.0 plus dye)。擴增 COⅠ片段的引物為： PcoF1 5’-CCTTCAA CTAATAAAAATATYAG-3’； LepR1 5’-TAAACTT CTGGATGTCCAAAAAATCA-3’[6]。COⅠ的 PCR 反應(yīng)程序參考[7]。使用1%的瓊脂糖膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢驗。最亮條帶的產(chǎn)物在ABI3730xlDNA分析儀（Applied Biosystems）中進行雙向測序。測序工作由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司完成。

2.2.3 序列分析

使用Bioedit軟件[8]比對序列。在MEGA6[9]中翻譯成蛋白質(zhì)，以檢驗是否有假基因的存在。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）是一個基于序列局部相似性的比對工具。該算法的基本思路是首先找出檢測序列和目標(biāo)序列之間相似性程度最高的片段，并作為內(nèi)核向兩端延伸，以便找出盡可能長得相似序列片段。川北采集到的盾蚧序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對。覆蓋90%區(qū)域相似度達到98%以上COⅠ序列被認定為該種（見表1）。

2.2.4 介殼蟲生活史研究

選擇介殼蟲危害較重的曾家鎮(zhèn)中柏村進行生活史研究。從樣株的東、南、西、北4個方向分別選擇1～2個1年生枝條，選取一段長20 cm的健康和受害并存枝條。其中，健康部位留取15 cm，受害部位內(nèi)留5～7個雌成蟲，各蟲之間保持一定距離，再于兩端涂凡士林阻止其他昆蟲爬入影響實驗結(jié)果[10]。開始每隔1 d觀察1次，并記各蟲態(tài)發(fā)育進程，待若蟲固定后，每周觀察2次，記錄其生活史發(fā)育進程。野外觀察期為3月下旬至10月中旬。每次在相鄰受害植株取各方位的一段帶蟲枝葉，帶回室內(nèi)在解剖鏡下詳細觀察同樣的內(nèi)容，作為固定觀察的補充。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

對制作的12分玻片標(biāo)本進行了形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果表明危害核桃的介殼蟲為桑白盾蚧Pseudaulacaspis pentagona（Targioni-Tozzetti）。桑白盾蚧屬于盾蚧科（Diaspididae）白盾蚧屬（PseudaulacaspisMac Gillivray）。

形態(tài)鑒定特征如下：觸角呈小突起，上有剛毛1根，著生在口器的前方，互相接近。前氣門伴有一群盤狀腺孔，約 6～17 個，后氣門沒有盤狀腺孔。各腹節(jié)側(cè)辦的腹面有很多腺刺，約5～10 個，后胸上有5～9 個。中胸側(cè)辦上有腺瘤。前胸區(qū)及中胸亞緣有微小的腺管分布。肛孔靠近臀板基部。圍陰腺5群。臀板背腺大小與邊腺相仿，背腺的腹節(jié)排列成行，背腺管管腺端口雙環(huán)。臀葉2～3對，中臀葉發(fā)達，左右兩片在基部有鞍片相連；第二臀葉分為兩瓣，內(nèi)瓣長過于闊，外瓣很小，不明顯。第三臀葉不發(fā)達，呈兩齒狀突出，相當(dāng)于第五和第四臀葉的位置，臀板邊緣也有相似的突出。第二和第三臀葉二分。背板緣鬃發(fā)達，端部刺狀或分叉。在中臀葉之間有剛毛1對（見圖1）。

3.2 分子鑒定

介殼蟲COⅠ基因PCR擴增，利用線粒體通用引物擴增介殼蟲COⅠ基因，PCR產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得690 bp單一明亮條帶，與預(yù)期目的基因片段大小一致（見圖2）。

圖1 （1.P. pentagona（Targioni-Tozzetti）（仿 Ferris 1936）2.玻片標(biāo)本 3.觸角 4.背腺管 5.臀板 6.前氣門 7.臀葉）Fig.1 Morphological characteristics of P. pentagona

圖2 COⅠ基因 PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose Gel Electrophoresis results of PCR amplification products of CO Ⅰ gene

去除兩端不穩(wěn)定的堿基，我們獲得2條669 bp的COⅠ序列，通過BLAST序列比對，相似度最高的前4個結(jié)果對應(yīng)的物種均為桑白盾蚧，相似度范圍為95.99～99.08%（見表2）。

3.3 桑白盾蚧生活史

自2018年4月至2019年11月，完成了桑白盾蚧野外生活史觀察。該蟲在川北地區(qū)1年發(fā)生2代，主要危害期在5月中旬至6月上旬、9月中旬至10月中旬，以受精雌成蟲在核桃枝干上越冬。3月中旬開始產(chǎn)卵，4月中旬為一齡若蟲孵化盛期，即若蟲大量涌散，尋找適宜的部位開始為害；5月上中旬開始以二齡若蟲固定在新梢、1年生枝條上開始取食危害；6月上旬開始化蛹，中下旬出現(xiàn)雌成蟲；8月下旬產(chǎn)下第2代卵；9月中下旬出現(xiàn)第2代一齡若蟲，開始危害核桃枝梢、葉柄和葉片；10月上旬為二齡若蟲危害盛期并出現(xiàn)雄蛹；10月中下旬出現(xiàn)雄成蟲和雌成蟲。

桑白盾蚧若蟲期蟲體尚未完全定殖，體表未分泌蠟質(zhì)，施藥能較好接觸蟲體，是防治該蟲的最佳時間。因此，在4月上旬至5月中旬、9月中旬至10月中旬施用觸殺性藥劑可以達到較好的防治效果，為林間最適防治時間。而成蟲分泌較厚的蠟質(zhì)介殼，一般藥劑難與蟲體接觸，防治效果不理想。

4 討論

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，弄清了危害核桃的介殼蟲為桑白盾蚧，基本掌握了該蟲在川北地區(qū)的年生活史。桑白盾蚧在隴南部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)造成危害，核桃園有蟲株率達到85%以上，對當(dāng)?shù)睾颂耶a(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅[11]，川北地區(qū)緊鄰隴南，結(jié)合川北大面積種植核桃的現(xiàn)狀，桑白盾蚧存在一定的擴散風(fēng)險。文獻資料表明，桑白盾蚧不僅危害核桃，還危害花椒、櫻桃、李、杏等經(jīng)濟林[12]，對龍泉驛區(qū)桃樹形成了嚴重威脅[13]，研究中還發(fā)現(xiàn)該蟲危害獼猴桃枝條和葉片。此外，在我省林業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和建設(shè)現(xiàn)代林業(yè)園區(qū)的需求下，現(xiàn)代核桃產(chǎn)業(yè)建設(shè)不僅需要應(yīng)對傳統(tǒng)核桃病蟲害危害，更有必要加強潛在或新發(fā)病蟲害的監(jiān)測和研究。王讓軍[11]發(fā)現(xiàn)在隴南地區(qū)該蟲的最佳防治時間為5月中上旬和8月上旬，朝天區(qū)維度偏南，物候相對較早，而8月極端溫度較高，造成第2代桑盾蚧發(fā)生相對較晚。

表1 BLAST 比對結(jié)果Tab.1 Comparison results of BLAST

表2 桑白盾蚧生活史Tab.2 Life history of P. pentogona

為有效避免核桃農(nóng)藥殘留，結(jié)合當(dāng)?shù)睾颂耶a(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的需求，可開展生物防治研究。劉茂祥[14]等人對桑樹上的桑盾蚧天敵種類進行了研究，共發(fā)現(xiàn)天敵11科23種。本次研究發(fā)現(xiàn)野外幾種桑白盾蚧天敵，分別是捕食性天敵紅星盤瓢蟲Phrynocaeia congener(Billberg)、二雙斑唇瓢蟲Chiloccrus lijugsMulsant和寄生性天敵繭蜂Phanerotomasp.，在進行必要的化學(xué)防治時應(yīng)注意對天敵昆蟲的保護。