林佳冰， 高曉東*， 胡必杰,2*， 陳 翔

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032

醫(yī)院感染是指住院病人在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染，包括在住院期間發(fā)生的感染和在醫(yī)院內(nèi)獲得、出院后發(fā)生的感染，但不包括入院前已開始或入院時(shí)已處于潛伏期的感染。醫(yī)院工作人員在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染也屬醫(yī)院感染[1]。而傳染性疾病較其他易發(fā)生院內(nèi)感染的疾病而言，危害性更大。住院患者免疫力低下，易受感染，同時(shí)大量患者需進(jìn)行氣管插管、導(dǎo)尿管或中心靜脈置管等感染高風(fēng)險(xiǎn)操作，一旦發(fā)生傳染性疾病的院內(nèi)傳播，將帶來巨大不良影響。因此，對(duì)醫(yī)院內(nèi)傳染性疾病患者進(jìn)行早期診斷并采取針對(duì)性的防控措施，對(duì)防止傳染性疾病的院內(nèi)傳播與暴發(fā)，具有重要意義。

近年來，隨著宏基因二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術(shù)在感染性疾病領(lǐng)域研究的不斷深入，基于mNGS的分子遺傳學(xué)檢測(cè)在感染性疾病中的診斷價(jià)值已逐漸被認(rèn)識(shí)，mNGS已在多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1]，如多種疾病的早期診治、遺傳學(xué)和微生物檢測(cè)等。但mNGS在醫(yī)院感染防控中的作用報(bào)道較少，因此，認(rèn)識(shí)mNGS在傳染性疾病的早期識(shí)別與診斷中的重要作用，對(duì)醫(yī)院感染防控早期干預(yù)意義重大。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2018年1月1日至2019年12月31日復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的5例傳染性疾病患者病例資料，包括一般資料、mNGS結(jié)果、常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果和醫(yī)院感染防控相關(guān)干預(yù)措施等。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者住院期間行mNGS檢測(cè)；(2)mNGS結(jié)果為傳染性疾病，且其傳播可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果；(3)mNGS的標(biāo)本質(zhì)量合格，標(biāo)本檢測(cè)過程中質(zhì)控合格，結(jié)果可靠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者住院期間未行mNGS；(2)mNGS結(jié)果為非傳染性疾病，或?yàn)閭魅拘约膊?，但其傳播不?huì)引起嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件；(3)mNGS過程中出現(xiàn)質(zhì)控不合格。

1.3 mNGS (1)樣本處理與核酸提?。喝獦?biāo)本取3～4 mL，預(yù)先離心后取上清液；除血以外標(biāo)本取0.5～3 mL。然后各類型標(biāo)本中加入玻璃珠混合震蕩，采用TIANamp Micro DNA Kit(DP315,TIANGEN BIOTECH)試劑盒進(jìn)行樣本DNA提取。(2)構(gòu)建文庫(kù)：采用Agilent 2100 Bio-analyzer和定量PCR進(jìn)行DNA文庫(kù)質(zhì)控，文庫(kù)經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)后，滾環(huán)復(fù)制形成DNB納米球備用。(3)測(cè)序：將DNB納米球加載到測(cè)序芯片，采用BGISEQ-500(華大基因，中國(guó))進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，比對(duì)微生物大數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)，將測(cè)序結(jié)果按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等進(jìn)行分類排列。

1.4 概念標(biāo)準(zhǔn) (1)醫(yī)院感染：對(duì)患者出院后該病區(qū)患者、醫(yī)務(wù)人員及其他密切接觸者隨訪30 d，觀察是否出現(xiàn)新發(fā)相似感染癥狀人員，判斷是否發(fā)生院內(nèi)傳播。(2)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防：針對(duì)所有病人的預(yù)防性措施，認(rèn)定病人的血液、體液、分泌物、排泄物、損傷的皮膚、黏膜和被這些物質(zhì)污染的物品具有潛在感染而采取的標(biāo)準(zhǔn)水平消毒、隔離等預(yù)防措施。無論患者是否確診或疑似感染，都要采取標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 結(jié)果(表1)顯示：5例患者納入本研究，均為男性，平均年齡為45.4歲。3例患者以發(fā)熱為主訴，1例以右上肢皮膚腫脹伴破潰流膿5 d為主訴，1例以左頸部搏動(dòng)性包塊1月余為主訴。5例患者中，有蟲咬史1例，有瘧疾感染史2例。

表1 5例傳染性疾病患者一般資料分析

2.2 mNGS和常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果比較 結(jié)果(表2)顯示：5例患者常規(guī)微生物培養(yǎng)均為陰性，mNGS結(jié)果：炭疽芽孢桿菌1例，霍亂弧菌1例，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群1例，三日瘧原蟲1例，惡性瘧原蟲1例。

2.2.1 患者A確診過程 2019年5月28日，送引流液行常規(guī)微生物培養(yǎng)，同時(shí)采集血標(biāo)本送檢mNGS。5月30日mNGS結(jié)果為炭疽芽孢桿菌，5月30日回報(bào)微生物培養(yǎng)結(jié)果為陰性。追問病史：患者于2019年5月初有著短袖搬運(yùn)死牛史，隨后出現(xiàn)右前臂傷口，結(jié)合mNGS結(jié)果及病史，初步確診炭疽。后續(xù)患者被轉(zhuǎn)至上海市公共衛(wèi)生中心，期間通過PCR進(jìn)一步確診炭疽。

表2 5例患者mNGS和常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果比較

2.2.2 患者B確診過程 2019年8月21日采集傷口拭子標(biāo)本送檢mNGS，8月23日結(jié)果為霍亂弧菌。8月28日送檢皮膚膿液及血行微生物培養(yǎng)，8月30日回報(bào)結(jié)果均為陰性。9月2號(hào)采集血標(biāo)本送檢mNGS，9月4日結(jié)果依然顯示霍亂弧菌，檢出大量唯一匹配的霍亂弧菌序列數(shù)，檢出結(jié)果明確，且患者為慢性肝病患者，考慮非O1/O139霍亂弧菌引起的皮膚軟組織感染。

2.2.3 患者C確診過程 2019年11月15日行痰涂片找抗酸桿菌和痰分枝桿菌培養(yǎng)，11月17日回報(bào)結(jié)果均為陰性。2019年12月18日采集痰標(biāo)本送檢mNGS，12月20日結(jié)果顯示：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。12月20日結(jié)核菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)結(jié)果示A/B：24/67。患者C入院時(shí)未考慮患傳染性疾病，住院過程中出現(xiàn)咳嗽、咳痰現(xiàn)象，但痰培養(yǎng)未見分枝桿菌，后根據(jù)mNGS結(jié)果及T-SPOT結(jié)果，確診結(jié)核。

2.2.4 患者D確診過程 2018年10月17日采集血標(biāo)本送檢mNGS，10月19日結(jié)果顯示：三日瘧原蟲。10月20日回報(bào)血涂片鏡檢找瘧原蟲及進(jìn)行寄生蟲全套抗體檢測(cè)結(jié)果，均為陰性?；颊逥有瘧疾感染史，檢出結(jié)果明確，同時(shí)結(jié)合患者此次生病期間發(fā)熱特點(diǎn)及流行病學(xué)史，確診瘧疾。

2.2.5 患者E確診過程 2019年1月7日行血涂片鏡檢找瘧原蟲，結(jié)果陰性，同時(shí)采集血標(biāo)本送檢mNGS，1月9日結(jié)果顯示：惡性瘧原蟲。1月11日經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所檢測(cè)后，結(jié)果為瘧疾快速診斷試劑卡顯示抗原陽(yáng)性，涂片陰性?；颊逧有瘧疾感染史，mNGS檢出結(jié)果明確，結(jié)合其流行病學(xué)史，確診瘧疾。

2.3 醫(yī)院感染防控措施的調(diào)整 結(jié)果(表3)顯示：5例患者入院時(shí)醫(yī)院感染防控措施均為標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防。根據(jù)mNGS結(jié)果，提早確診傳染性疾病并調(diào)整醫(yī)院感染防控措施，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播新發(fā)病例。

表3 醫(yī)院感染防控措施的調(diào)整和病例隨訪情況

2.3.1 患者A的防控措施 及時(shí)將患者A轉(zhuǎn)入負(fù)壓?jiǎn)伍g病房進(jìn)行隔離，相關(guān)醫(yī)護(hù)人員嚴(yán)格進(jìn)行手衛(wèi)生與口罩防護(hù)，對(duì)于需要進(jìn)行密切接觸操作者，要求穿戴隔離衣及防護(hù)鞋，必要時(shí)佩戴護(hù)目鏡或面罩?；颊咚褂冕t(yī)療設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格消毒，加強(qiáng)環(huán)境清潔，患者出院后使用過氧化氫消毒機(jī)進(jìn)行房間的終末消毒。對(duì)患者日常所更換被服及出院后的各種床單元用品統(tǒng)一裝入感染性織物袋中進(jìn)行清潔消毒，規(guī)范處置該患者的醫(yī)療廢物。同時(shí)聯(lián)系我院防保科，進(jìn)行病例上報(bào)，并請(qǐng)具有專業(yè)傳染病防控診治的上海市公共衛(wèi)生中心專家會(huì)診，會(huì)診后轉(zhuǎn)至該中心進(jìn)一步治療。經(jīng)上述干預(yù)后，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.2 患者B的防控措施 霍亂通常由產(chǎn)霍亂毒素的O1/O139霍亂弧菌引起，在我國(guó)屬于甲類傳染病，但患者B未出現(xiàn)霍亂典型臨床表現(xiàn)——排“米泔樣”便。本患者為乙肝患者，血mNGS及皮膚傷口拭子均提示霍亂弧菌，培養(yǎng)結(jié)果均陰性，考慮非O1/O139霍亂弧菌可能性大，其傳播力較O1/O139霍亂弧菌弱，但仍需重視，因此對(duì)該患者加強(qiáng)接觸預(yù)防措施，相關(guān)接觸預(yù)防措施同患者A。同時(shí)聯(lián)系我院防保科，進(jìn)行病例上報(bào)。對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)霍亂弧菌引起的皮膚軟組織感染治療后，患者病情好轉(zhuǎn)出院，且隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.3 患者C的防控措施 及時(shí)將該患者轉(zhuǎn)移至單間隔離，醫(yī)務(wù)人員加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)，佩戴醫(yī)用防護(hù)口罩，高危操作時(shí)佩戴N95口罩，嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，盡量避免家屬探視，加強(qiáng)通風(fēng)。同時(shí)請(qǐng)上海市公共衛(wèi)生中心專家進(jìn)行會(huì)診，后續(xù)轉(zhuǎn)至該中心進(jìn)一步治療。經(jīng)上述干預(yù)后，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.4 患者D的防控措施 針對(duì)患者D，要特別注意防蚊滅蚊，避免蚊蟲帶來傳播，保持病區(qū)干凈衛(wèi)生，注意通風(fēng)。同時(shí)給予患者D正規(guī)抗瘧治療，患者好轉(zhuǎn)出院。經(jīng)上述干預(yù)后，隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

2.3.5 患者E的防控措施 請(qǐng)上海市公共衛(wèi)生中心感染科會(huì)診進(jìn)行進(jìn)一步病例確認(rèn)，調(diào)整后防控措施同患者D，同時(shí)給予患者E正規(guī)抗瘧治療，患者好轉(zhuǎn)出院。隨訪30 d內(nèi)，未出現(xiàn)院內(nèi)傳播的新發(fā)病例。

3 討 論

傳染性疾病是由各種病原體引起的，能在人與人、動(dòng)物與動(dòng)物或人與動(dòng)物之間相互傳播的一類疾病。2020年1月20日，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將新型冠狀病毒肺炎納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病。中國(guó)目前的法定傳染病有甲、乙、丙3類，共40種。其中不乏傳播能力強(qiáng)、致病力強(qiáng)的疾病，故傳染病仍是一個(gè)十分重要的公共衛(wèi)生問題[5]。如果不能對(duì)其進(jìn)行早期識(shí)別，并給予針對(duì)性的防控措施，一旦發(fā)生院內(nèi)傳播，將對(duì)醫(yī)院內(nèi)患者造成巨大威脅，甚至形成影響嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。

在醫(yī)院的日常診療工作中，難免需要接觸許多處于潛伏期或傳染期的傳染性疾病患者，同時(shí)，醫(yī)院人流量大、交叉感染風(fēng)險(xiǎn)高，存在免疫力低下患者等眾多高危人群，傳播環(huán)節(jié)多且不易控制到位。并且許多醫(yī)院，特別是基層醫(yī)院普遍不重視傳染性疾病防控，一旦出現(xiàn)嚴(yán)重傳染性疾病暴發(fā)，后果不堪設(shè)想[6]。

目前傳染性疾病的診斷主要依賴常規(guī)微生物培養(yǎng)法[7]。國(guó)內(nèi)絕大部分臨床微生物實(shí)驗(yàn)室均采用基于生化反應(yīng)的自動(dòng)或半自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。MALDI-TOF MS技術(shù)可分離細(xì)菌和真菌[8]，但因儀器價(jià)格與技術(shù)等原因，目前尚未在基層醫(yī)院廣泛使用。但是，由于標(biāo)本培養(yǎng)采集不規(guī)范、送檢時(shí)機(jī)不合理[9]及某些苛養(yǎng)菌常規(guī)方法難以培養(yǎng)等原因，常規(guī)微生物培養(yǎng)常呈現(xiàn)陰性結(jié)果，并且對(duì)一些少見、罕見及菌種復(fù)合體的鑒定，結(jié)果也不十分可靠[10-11]。而對(duì)病毒、寄生蟲的檢測(cè)，常規(guī)醫(yī)院更是難以開展[12]。因此，借助常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果鑒別診斷傳染性疾病時(shí)，感染控制部門常無法對(duì)疾病進(jìn)行早期、準(zhǔn)確地診斷，也就無法及時(shí)采取合適的防控措施，嚴(yán)重影響了傳染性疾病的防控工作。

mNGS檢測(cè)范圍覆蓋細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲，可在病原體未知的情況下尋找病原體，比起傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，監(jiān)測(cè)范圍更廣、靈敏度更高[13]。目前mNGS在醫(yī)院感染方面的應(yīng)用，大多只涉及醫(yī)療機(jī)構(gòu)環(huán)境的污染檢測(cè)、利用全基因測(cè)序?qū)︶t(yī)院感染暴發(fā)進(jìn)行追蹤及耐藥基因組研究等領(lǐng)域[14-16]，而對(duì)醫(yī)院感染防控中很重要的早期干預(yù)的應(yīng)用還較少。mNGS在其他研究中體現(xiàn)出檢出率高、耗時(shí)短、精確性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[17-18]，如能應(yīng)用到感染性疾病的早期診斷中，提早對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)性的干預(yù)措施，做好防護(hù)工作，保護(hù)高危人群，降低醫(yī)院傳播的風(fēng)險(xiǎn)，將會(huì)大大提升傳染性疾病的醫(yī)院感染防控工作效果。

本研究結(jié)果顯示，mNGS可有效發(fā)現(xiàn)未知傳染性病原體，快速鑒定疾病病原體，在最短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確獲取病原體的全面信息，同時(shí)，還可幫助進(jìn)行傳染性疾病的早期診斷，調(diào)整患者的治療方案，對(duì)有效控制傳染性疾病疫情也起到了決定性作用。并且，通過將mNGS的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化，克服了診斷標(biāo)準(zhǔn)不明確、成本高的缺點(diǎn)[19-20]，使得mNGS在傳染性疾病早期診斷中應(yīng)用更為明確。若將mNGS常規(guī)化，將來可為醫(yī)院感染防控工作做出更大貢獻(xiàn)。

綜上所述，mNGS在傳染性疾病的早期識(shí)別與診斷中具有重要作用，可對(duì)醫(yī)院感染防控早期干預(yù)起到良好的指導(dǎo)效果。