金文婷， 李 娜， 周曉崗， 張 堯， 黃英男， 蘇 逸， 姚雨濛， 繆 青， 馬玉燕， 李 冰， 王青青， 王萌冉， 駱 煜， 蔡思詩， 潘 玨， 胡必杰

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032

脊柱感染包括脊椎骨髓炎、椎間盤炎和硬膜外膿腫，常由遠(yuǎn)處病灶血行播散至一個(gè)或多個(gè)椎體引起[1]。感染可累及鄰近椎間隙，也可在手術(shù)[2]或椎間隙注射后發(fā)生，或從鄰近軟組織鄰接播散而來。脊柱感染是引起腰背痛的潛在原因之一，雖然臨床發(fā)病率不高，但一旦發(fā)生，如不及時(shí)和恰當(dāng)治療，將造成破壞性的損害。

導(dǎo)致脊柱感染最常見的病原體為金黃色葡萄球菌，其他病原體包括大腸埃希菌、念珠菌、鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、布魯菌等[3]。目前脊柱感染病原體的檢測方法主要基于病史聯(lián)合血培養(yǎng)或血清學(xué)檢測結(jié)果，但陽性率普遍較低，不利于疾病的早診早治。宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技術(shù)是新興的病原體檢測手段，已被廣泛應(yīng)用于血液[4-5]、呼吸道標(biāo)本[6-7]、腦脊液[8-9]、人工關(guān)節(jié)標(biāo)本[10-11]等多種標(biāo)本的檢測，取得了顯著成效，但目前缺乏其在脊柱感染病原學(xué)診斷中的應(yīng)用分析。因此，本研究以疑似脊柱感染患者為研究對象，采用常規(guī)微生物培養(yǎng)法和mNGS技術(shù)檢測脊柱感染組織標(biāo)本，對比診斷效能，探討mNGS對脊柱感染病原學(xué)診斷的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月至2019年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的疑似脊柱感染患者，共24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于14周歲；臨床懷疑脊柱感染；進(jìn)行CT引導(dǎo)下脊柱病灶穿刺或脊柱手術(shù)；留取穿刺或手術(shù)組織；病理排除腫瘤性疾??；骨組織勻漿行mNGS檢測及常規(guī)微生物培養(yǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：穿刺或手術(shù)組織勻漿太少僅行常規(guī)微生物培養(yǎng)，未送組織行mNGS。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No. B2017-193R)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 常規(guī)微生物學(xué)培養(yǎng) 研磨穿刺組織標(biāo)本成組織勻漿，分別接種于血瓊脂平板、巧克力平板行細(xì)菌培養(yǎng)，接種于念珠菌顯色平板、沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)平板行真菌培養(yǎng)，分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(MGIT960)進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。

1.3 mNGS

1.3.1 樣本處理及DNA提取 穿刺組織標(biāo)本經(jīng)研磨成組織勻漿，取0.6～0.7 mL勻漿，經(jīng)玻璃珠混合震蕩后按照TIANamp DNA提取試劑盒(DP316, 天根生化科技有限公司，中國)步驟提取DNA。

1.3.2 文庫構(gòu)建和測序 采用Agilent2100生物分析儀(Agilent，美國)質(zhì)控文庫插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS 分析試劑盒(Thermo Fisher，美國)質(zhì)控DNA文庫濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNA納米球(DNA nanoball，DNB)。制備好的DNB加載到測序芯片，采用BGISEQ-50高通量臺(tái)式測序系統(tǒng)(深圳華大基因科技有限公司，中國)進(jìn)行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 測序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量的和長度小于35 bp的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。通過BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對，將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除。剩余數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度序列后與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫比對，并將比對后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等進(jìn)行分類和排列。

1.4 mNGS陽性標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌：種水平覆蓋度為其他任何微生物10倍以上(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群嚴(yán)格比對序列數(shù)至少1條)；真菌：種水平覆蓋度為其他真菌5倍以上；病毒：種水平覆蓋度為其他病毒5倍以上。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 疑似脊柱感染患者共24例，男性17例，女性7例；年齡14～78歲，平均年齡為(54.0±19.0)歲，紅細(xì)胞沉降(56.2±19.6)mm/h, C-反應(yīng)蛋白(46.7±62.5)mg/L。

2.2 陽性率比較 結(jié)果(圖1A)顯示：共24例樣本，mNGS陽性結(jié)果17例，符合臨床診斷的結(jié)果15例，2例不確定，符合臨床診斷的陽性率62.5%(15/24)。4例因穿刺標(biāo)本有限，僅送mNGS檢測，未送常規(guī)微生物培養(yǎng)。常規(guī)微生物培養(yǎng)7例陽性結(jié)果，陽性率為35.0%(7/20)。

2.3 檢測時(shí)間比較 結(jié)果(圖1B)顯示：mNGS平均檢測時(shí)間為36～48 h，明顯低于常規(guī)培養(yǎng)的檢出平均時(shí)間21.8 d。

2.4 病例檢測結(jié)果與臨床診斷符合情況 結(jié)果(圖2)顯示：符合臨床診斷的15例患者中結(jié)核分枝桿菌6例，金黃色葡萄球菌5例，大腸埃希菌2例，馬爾尼菲藍(lán)狀菌1例，諾卡菌1例。常規(guī)培養(yǎng)陽性共7例，其中6例與mNGS結(jié)果一致，1例培養(yǎng)結(jié)果為野油黃單胞菌(考慮污染可能性大)。

圖1 常規(guī)微生物培養(yǎng)法和mNGS的陽性率(A)和檢測時(shí)間(B)比較

圖2 24例病例樣本檢測結(jié)果與臨床診斷符合情況

2.4 典型病例簡介 在常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果陰性情況下，mNGS額外檢出9例符合臨床意義的病原體，其中結(jié)核分枝桿菌4例，金黃色葡萄球菌3例，大腸埃希菌1例，諾卡菌1例?，F(xiàn)將其中3例典型病例報(bào)告如下。

2.4.1 典型病例PT6 男性，61歲，11個(gè)月前確診肺結(jié)核，至今仍處于治療中。9個(gè)月前開始胸背痛，胸椎MRI平掃(圖3A)示T9椎體楔形變，T8-9椎體信號(hào)異常，T2抑脂高信號(hào)，T1WI呈低信號(hào)，臨近軟組織稍腫脹，信號(hào)高。CT引導(dǎo)下穿刺未見肉芽腫及凝固性壞死，抗酸染色陰性；胸部CT(圖3A)示右肺上葉結(jié)節(jié)病灶伴纖維條索影。入院前胸椎MRI平掃(圖3B)示T9椎體明顯楔形變，T8-9椎體信號(hào)異常，T2抑脂呈高信號(hào)，T1WI呈低信號(hào)，鄰近軟組織腫脹、信號(hào)增高，T8-9椎間盤內(nèi)見斑片狀長T2WI信號(hào)影，椎體邊緣見骨質(zhì)增生征象?？菇Y(jié)核過程中，脊柱病灶逐漸增大并出現(xiàn)壓迫癥狀，曾穿刺培養(yǎng)，但無結(jié)核證據(jù)。脊柱穿刺組織液的細(xì)菌、真菌、分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，脊柱組織經(jīng)mNGS檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群2條。

2.4.2 典型病例PT20 男性，15歲，腰痛2月就診，炎癥標(biāo)志物升高不明顯，結(jié)核菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)結(jié)果為陰性。腰椎病灶穿刺病理僅提示慢性炎癥伴纖維組織增生。腰椎MRI(圖4A)示L3下緣、L4椎體上緣骨質(zhì)破壞，伴局部骨質(zhì)硬化，腰L3-4椎間隙變窄，鄰近腰大肌未見明顯腫大及異常強(qiáng)化灶。該患者影像學(xué)不排除結(jié)核但依據(jù)不足，外院仍建議抗結(jié)核治療，且用藥后消化道副反應(yīng)明顯。穿刺組織mNGS檢出諾卡菌屬，為該患者提供了重要的病原學(xué)依據(jù)，抗諾卡菌治療后復(fù)查MRI(圖4B)明顯好轉(zhuǎn)。

圖3 PT6脊柱結(jié)核合并肺結(jié)核影像學(xué)資料

圖4 PT20諾卡菌脊柱感染治療前后腰椎MRI圖像

2.4.3 典型病例PT24 男性，68歲，因發(fā)熱待查收治入院，外院曾血培養(yǎng)示大腸埃希菌。入院后炎癥標(biāo)志物升高，多次血培養(yǎng)結(jié)果均陰性，血mNGS檢出大腸埃希菌序列。因無法確定脊柱病灶是否可用大腸埃希菌血流感染一元論解釋，行CT引導(dǎo)下胸椎病灶穿刺，病理結(jié)果示：部分為骨組織，骨組織中骨小梁間可見增生纖維組織、骨髓造血組織，其部分區(qū)可見大量中性粒細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞浸潤，傾向急性炎癥。PET/CT(圖5A、5B)示L3椎體及L4椎體后部見溶骨性骨質(zhì)破壞伴糖代謝異常增高，最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV值)分別約為15.2和14.4；腰椎MRI(圖5C)示L3信號(hào)異常，T1WI呈稍低信號(hào)，T2WI呈不均勻稍高信號(hào)，顯著強(qiáng)化，L4椎體見可疑類似信號(hào)，椎管前緣局部強(qiáng)化。骨組織mNGS檢出大量大腸埃希菌序列(種嚴(yán)格序列數(shù)8 116條)。

圖5 PT24大腸埃希菌脊柱感染腰椎PET/CT及MRI圖像

3 討 論

脊柱感染發(fā)病率低，感染病科、骨科及影像科醫(yī)生很難將其與非感染性疾病區(qū)分，且很難鑒別感染病原體，更多會(huì)經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療。mNGS是一種非培養(yǎng)技術(shù)，能夠快速全面地檢測病原體，之前研究[12]結(jié)果也顯示，mNGS具有更高的病原體鑒定靈敏度，且受抗生素暴露影響小。

對于難以診斷的脊柱感染病例，診斷性穿刺活檢是確診并鑒別診斷的最佳方案。但有研究[13]顯示，經(jīng)CT引導(dǎo)下穿刺的陽性率為47%～100%。但若穿刺前接受過抗感染治療，活檢微生物結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。本研究結(jié)果也顯示，組織病理診斷缺乏特異性，對結(jié)核、真菌等感染部分可有肉芽腫改變、抗酸染色或過碘酸希夫染色(PAS)、六胺銀染色陽性的結(jié)果，但對于細(xì)菌性感染組織學(xué)可能并無特異性改變，只表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤或膿腫形成。

本研究結(jié)果顯示，mNGS的總體陽性率高于常規(guī)培養(yǎng)(62.5%vs30.0%)，檢出病原體主要為結(jié)核分枝桿菌，骨結(jié)核在肺外結(jié)核中發(fā)病率約為10%[14]。本研究檢出率高可能與中國結(jié)核患者基數(shù)大及本病區(qū)收治病種有關(guān)。其次為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，細(xì)菌性病原體的檢出情況與既往文獻(xiàn)報(bào)道[2]相符。分枝桿菌及其他細(xì)菌的mNGS檢出率都高于常規(guī)培養(yǎng)，且檢測時(shí)間上存在明顯優(yōu)勢，36～48 h即可取得結(jié)果，而分枝桿菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)通常耗時(shí)較長，陽性率低，故mNGS在檢出陽性率及檢出時(shí)間上均有優(yōu)勢。以往研究[15]顯示，對于培養(yǎng)陽性率低或培養(yǎng)時(shí)間長的病原體，mNGS檢測具有優(yōu)勢，與本研究結(jié)論一致。圖2中mNGS與臨床診斷情況相符的患者中，在疾病診治早期，mNGS為治療方案的決策提供了非常重要的依據(jù)。

mNGS因其具有無靶病原檢測的特性，理論上可檢測樣本中所有微生物信息，可能檢出多種病原體，也可能出現(xiàn)檢出多種病原體但無法確定致病病原體或無法確定是否與臨床相符的情況[16]。例如PT3脊柱骨折術(shù)后發(fā)熱患者，mNGS檢出大量人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、丙酸痤瘡桿菌和少量非結(jié)核分枝桿菌，此時(shí)還需要結(jié)合臨床資料及有經(jīng)驗(yàn)的感染病科醫(yī)生來綜合決策。本研究中有3例結(jié)核病例出現(xiàn)假陰性的情況，可能與結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)菌，目前破壁技術(shù)局限有關(guān)。

綜上所述，mNGS能夠快速檢測脊柱感染病原體，為臨床早期精準(zhǔn)治療提供重要的病原學(xué)依據(jù)。