彭 利，馬文軍，崔潔潔，龔夢嘉，何 昀△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院：1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科；2.兒科研究所干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

肝功能衰竭是臨床最常見的病死率極高的肝病癥候群，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。治療肝衰竭最有效的方法是肝移植，但由于供肝來源嚴(yán)重缺乏，手術(shù)難度高等，導(dǎo)致很大一部分患者得不到移植的機(jī)會。最新研究結(jié)果顯示，肝干細(xì)胞移植在急慢性肝功能衰竭的治療中有重要作用，但也存在著肝細(xì)胞在體外不能大量擴(kuò)增且傳代后不能保持其原有細(xì)胞特性的問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝干細(xì)胞具有長時間持續(xù)增生的能力，并且能在體外擴(kuò)增獲得足夠的細(xì)胞數(shù)，但如何篩選和優(yōu)化穩(wěn)定的誘導(dǎo)體系、使肝干細(xì)胞定向分化在目前階段亟待解決。Wnt信號通路在細(xì)胞增殖、分化、生長、遷徙及氧化應(yīng)激等多方面有復(fù)雜的信號級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控肝臟發(fā)育和肝細(xì)胞分化[2-4]。迄今為止，對于肝細(xì)胞分化及其調(diào)控信號通路研究主要集中于β-catenin[5]，而對Wnt信號其他成員的研究相對較少。因此，本研究將集中探討Wnt家族成員對小鼠胚胎肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響，篩選出最優(yōu)通路和誘導(dǎo)因素，以期建立有效的肝干細(xì)胞定向分化體系，為臨床肝細(xì)胞移植治療肝衰竭提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑及材料 DMEM培養(yǎng)基、熒光素酶檢測試劑盒(NEB公司)、胎牛血清(Gibco公司)、清蛋白(ALB)抗體 (Santa Cruz)，實(shí)時熒光定量PCR試劑(Real-time PCR-SYBR?Green Ⅱ,寶生物工程公司)，糖原(PAS)染色試劑盒(SIGMA公司)，吲哚菁綠(ICG)試劑(SIGMA公司)。

1.2細(xì)胞與腺病毒感染 小鼠胚胎肝祖干細(xì)胞HP14-19由美國芝加哥大學(xué)腫瘤研究中心贈送，HEK293 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。HP14-19 在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。19種Ad-Wnt腺病毒和表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)(陰性對照)由美國芝加哥大學(xué)腫瘤研究中心饋贈，擴(kuò)增腺病毒，當(dāng)細(xì)胞感染率達(dá)到95%時，收集細(xì)胞并離心，得病毒液，-80 ℃保存。病毒感染細(xì)胞接種于24孔板上，24 h熒光顯微鏡檢測GFP表達(dá)。

1.3熒光素酶活性檢測 在24孔板上接種攜帶ALB-Gluc報告基因的HP14-19細(xì)胞，分別加入Ad-GFP和Ad-Wnt病毒液，在轉(zhuǎn)染后的第4、6、9天取上清液檢測熒光素酶活性。每組設(shè)置復(fù)孔，重復(fù)試驗(yàn)3次，在酶標(biāo)儀上選擇470 nm波長處讀數(shù)。

1.4實(shí)時熒光定量PCR檢測delta蛋白(DLK)、甲胎蛋白(AFP)等肝細(xì)胞特征性標(biāo)志物mRNA水平 采用SYBR Green?Ⅰ染料法檢測各組細(xì)胞中 DLK、ALB、AFP、上皮特異性標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白18(CK18)等標(biāo)志物 mRNA的表達(dá)量。分別收集各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染9 d后總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，實(shí)時熒光定量PCR：SRBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，模板cDNA 2 μL，上下引物各0.5 μL (10 μmol/L)，滅菌雙蒸水10 μL。PCR條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5PAS染色實(shí)驗(yàn) HP14-19細(xì)胞加入Ad-GFP和Ad-Wnt3a病毒液。棄原培養(yǎng)基， 4%多聚甲醛固定15 min；后加入高碘酸溶液，室溫放置5 min；希夫試劑染色15 min；蘇木染色1 min；流水沖洗2 min，1%氨水10 s，流水沖洗。顯微鏡觀察。

1.6ICG攝取功能檢測實(shí)驗(yàn) HP14-19細(xì)胞分別加入Ad-GFP和Ad-Wnt3a病毒液，24孔板進(jìn)行分化培養(yǎng)，加入配制好的ICG工作液于24孔板中(500 μL/孔)，在37 ℃中孵育1 h；顯微鏡下觀察細(xì)胞被誘導(dǎo)后的ICG攝取情況及細(xì)胞形態(tài)變化，拍照記錄。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫熒光染色結(jié)果 重組腺病毒Ad-GFP 和Ad-Wnt 1-16均能夠高效轉(zhuǎn)染 HP14-19 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率為60%～80%，其中GFP、Wnt3a、Wnt5b和Wnt11轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖1 。

2.2熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果 19種Wnt腺病毒均能有效感染HP14-19細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)的Wnt信號蛋白，隨著處理時間的延長，熒光素酶值的讀數(shù)逐漸升高，組間比較發(fā)現(xiàn)，Wnt2、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8a組較GFP陰性對照組明顯增高，其中Wnt3a的作用最明顯。 見圖2。

圖1 不同重組腺病毒對HP14-19細(xì)胞的感染情況(200×)

圖2 HP14-19轉(zhuǎn)染后第4、6、9天的ALB-GLuc活性

2.3mRNA表達(dá)情況比較 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，Ad-Wnt3a組肝干細(xì)胞標(biāo)志DLK、AFP表達(dá)明顯下降；肝細(xì)胞特異性成熟標(biāo)志ALB、CK18明顯上調(diào)(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 肝表面標(biāo)志物DLK、AFP、ALB、CK18的mRNA表達(dá)情況

圖4 Ad-Wnt3a處理后HP14-19細(xì)胞PAS染色情況(100×)

2.4PAS染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果 HP14-19細(xì)胞PAS染色呈弱陽性，而Ad-Wnt3a處理后10 d，PAS染色可見70%～80%的細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量紫紅色顆粒，細(xì)胞形態(tài)由多角形變?yōu)殚L梭形(圖4)。

2.5ICG攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果 HP14-19細(xì)胞幾乎沒有ICG攝取能力，但經(jīng)Ad-Wnt3a處理后，ICG攝取實(shí)驗(yàn)可見大量綠色圓形或者多邊形陽性細(xì)胞(圖5)。

圖5 Ad-Wnt3a處理后HP14-19細(xì)胞ICG攝取情況(100×)

3 討 論

肝功能衰竭是臨床最常見的肝病癥候群，其病死率高，且在我國發(fā)病率呈上升趨勢。肝癌干細(xì)胞/前體細(xì)胞理論的提出是人們對肝臟疾病及其治療認(rèn)識的新開始[6]。肝干細(xì)胞移植已經(jīng)成功應(yīng)用在動物模型及體外試驗(yàn)中[7-8]，但其在細(xì)胞的再生、分化中的作用機(jī)制仍沒有明確。深入開展胚胎肝干細(xì)胞分化成熟機(jī)制的研究對認(rèn)識肝臟發(fā)育、治療肝衰竭及肝干細(xì)胞的臨床應(yīng)用有重要作用。

肝干細(xì)胞的分化是一個復(fù)雜、受多種因素影響的過程，多種因子和通路在促進(jìn)分化的過程中起關(guān)鍵性調(diào)控作用。Wnt信號通路具有廣泛的生物學(xué)功能，在多種細(xì)胞增殖、分化、生長、遷徙及氧化應(yīng)激等多方面有復(fù)雜的信號級聯(lián)反應(yīng)，也在肝臟發(fā)育和肝細(xì)胞分化調(diào)控中具有重要作用?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的Wnt蛋白有19種，分別參與了細(xì)胞生長分化、胚胎形成及腫瘤發(fā)生過程[9]。本研究中，通過ALB啟動子啟動的熒光素酶報告基因活性檢測篩選發(fā)現(xiàn)，Wnt2、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8a均能有效誘導(dǎo)肝細(xì)胞清蛋白表達(dá)，其中Wnt3a組ALB熒光素酶活性最高，提示W(wǎng)nt3a可在成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá)。HP14-19細(xì)胞自身PAS染色呈弱陽性，幾乎沒有ICG攝取能力，而經(jīng)Ad-Wnt3a處理后，70%～80%的細(xì)胞PAS染色可見陽性，ICG攝取實(shí)驗(yàn)可見大量綠色圓形或者多邊形陽性細(xì)胞，證實(shí)Wnt3a誘導(dǎo)的HP14-19細(xì)胞可表達(dá)成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志物，由此得出結(jié)論，Wnt3a能夠誘導(dǎo)HP14-19向成熟肝細(xì)胞分化。Wnt3a是Wnt蛋白中一種重要的亞型，其分布廣泛，調(diào)節(jié)基因多樣，主要通過經(jīng)典Wnt信號途徑發(fā)揮作用[10-11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)rizzeld受體的同源分泌形式即分泌型同源卷曲蛋白家族(SFRPs)能夠與Wnt蛋白特異性結(jié)合，從而競爭性抑制Wnt蛋白與Frizzeld受體結(jié)合，阻止信號傳導(dǎo)[12]。Frzb是SFRP2的一個亞型，二者僅可在發(fā)育早期的肝組織中被檢測到，而成熟階段的肝細(xì)胞中幾乎檢測不到，即Frzb的表達(dá)下調(diào)，由此推測在肝細(xì)胞的分化過程中，Wnt3a高表達(dá)而其拮抗因子Frzb表達(dá)下調(diào)可能是肝臟發(fā)育和肝細(xì)胞分化所必需的。

研究發(fā)現(xiàn)Ad-Wnt3a 誘導(dǎo)HP 14-19 細(xì)胞高表達(dá) Wnt3a后，PAS染色結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，同時實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，HP14-19細(xì)胞中CK18的表達(dá)量明顯下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)Wnt 信號途徑在小鼠肝前體細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 的過程中發(fā)揮重要作用[13]，但其具體的機(jī)制仍不明確。Wnt3a是Wnt經(jīng)典途徑的代表蛋白[14-15]，此外，Wnt3a的高表達(dá)可以顯著升高EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，而Snail作為EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過抑制間質(zhì)標(biāo)志物E-鈣黏附蛋白的表達(dá)使N-鈣黏附蛋白表達(dá)上調(diào)，從而削弱細(xì)胞間的連接，誘導(dǎo)EMT發(fā)生[16]。由此，研究者推斷Wnt3a在誘導(dǎo)HP14-19向成熟肝細(xì)胞分化的同時介導(dǎo)了EMT的發(fā)生。

4 結(jié) 論

Wnt信號通路在肝臟發(fā)育和肝細(xì)胞分化調(diào)控中具有重要作用。本研究利用不同Wnt蛋白基因的19種重組腺病毒，分別感染HP14-19細(xì)胞，通過熒光素酶報告系統(tǒng)篩選、肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)檢測，PAS實(shí)驗(yàn)和ICG攝取實(shí)驗(yàn)檢測肝細(xì)胞功能，Wnt3a蛋白是誘導(dǎo)HP14-19細(xì)胞成熟分化的重要蛋白，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞類似于成熟肝細(xì)胞，有較強(qiáng)的合成代謝功能。研究結(jié)果進(jìn)一步說明了Wnt蛋白在肝干細(xì)胞分化調(diào)控中的作用，對進(jìn)一步研究肝干細(xì)胞分化調(diào)控及肝移植應(yīng)用有重要意義。