朱 麗，孔祥珍，華欲飛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122)

大豆是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的家庭用或工業(yè)加工用食品材料，應(yīng)用性極廣[1]。但大豆作為八大食物致敏原之一，輕者可出現(xiàn)過(guò)敏性皮炎、腹痛腹瀉、惡心嘔吐等過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重者會(huì)休克甚至死亡[2-3]。大豆中的過(guò)敏成分主要來(lái)源于大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白是伴大豆球蛋白(7S)的主要存在形式，且后者比前者更易引起過(guò)敏反應(yīng)[4]，研究發(fā)現(xiàn)組成β-伴大豆球蛋白的3種亞基——α′、α及β亞基都具有致敏性[5]。

熱處理是食品加工中最常用的工序之一。加熱處理能夠引起蛋白質(zhì)的變性，由于分子相互作用發(fā)生聚集和/或二硫鍵重排等導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象表位的破壞，在某些情況下大豆致敏性可因此被降低[6]，但之后的研究發(fā)現(xiàn)新暴露出的IgE的結(jié)合位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致大豆致敏性增加[7]。所以，加熱處理對(duì)于大豆致敏性的降低并不是很理想。蛋白酶酶解常用于降低抗原蛋白的致敏性，其通過(guò)使肽段斷裂，從而最大程度地破壞蛋白的線性表位及構(gòu)象表位。Keum等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大豆7S蛋白經(jīng)過(guò)胃蛋白酶酶解，其抗原性降低了50%以上。黃婷等[9]用堿性蛋白酶處理β-伴大豆球蛋白40 min，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率為33.48%。Wang等[10]用胰蛋白酶酶解豆粕12 min，β-伴大豆球蛋白抗原性殘留率約為30%，但堿性蛋白酶酶解10 min，抗原性殘留率僅為4%。目前關(guān)于大豆蛋白經(jīng)加熱預(yù)處理后，再進(jìn)行蛋白酶酶解對(duì)其分子結(jié)構(gòu)及抗原性的影響方面報(bào)道較少。

本研究采用不同的加熱條件聯(lián)合不同的酶解方式考察大豆7S蛋白分子結(jié)構(gòu)及抗原性的變化。采用SDS-PAGE考察酶解后大豆7S蛋白的降解情況，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法考察酶解物的抗原性，并通過(guò)質(zhì)譜鑒定抗消化肽段的蛋白來(lái)源，旨在為脫敏食品的加工處理提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

低溫脫脂豆粕，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；胃蛋白酶(≥1 200 U/g)、胰蛋白酶(1∶250)、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、亞硫酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、五水硫酸銅、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、乙酸、甲醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)、2,4-二硫蘇糖醇(DTT)、考馬斯亮藍(lán)R-250、三氯乙酸(TCA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺(Acr)，北京百靈威科技有限公司；β-伴大豆球蛋白定量檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物技術(shù)公司。

Himac CR21 GII 冷凍離心機(jī)，日本日立公司；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀；酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；SC-15 智能節(jié)能恒溫槽；pH計(jì)，梅特勒-托利多公司；垂直電泳儀、凝膠成像儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆7S蛋白的提取

參照Nagano等[11]的方法并做適當(dāng)修改。將低溫脫脂豆粕與10倍體積去離子水室溫低速攪拌混合1 h，兩層紗布過(guò)濾去除殘?jiān)锨逡涸?℃下15 800g離心30 min，加入亞硫酸氫鈉溶液使其質(zhì)量濃度為0.98 g/L，然后調(diào)節(jié)pH至6.4，靜置過(guò)夜， 4℃下12 000g離心20 min，收集上清液。在上清液中加入氯化鈉使其濃度為0.25 mol/L,調(diào)節(jié)pH至5.0，4℃下15 800g離心30 min，再次收集上清液，加入等體積4℃預(yù)冷去離子水，調(diào)pH至4.8，4℃下12 000g離心20 min，收集沉淀，調(diào)pH至7.0，濃縮干燥，得大豆7S蛋白，4℃儲(chǔ)藏備用。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

1.2.3 加熱處理

配制3%的大豆7S蛋白溶液，于70、80、90℃恒溫水浴中分別加熱10、20 min，加熱完畢后置于冰水浴中迅速冷卻，4℃保存待用。

1.2.4 蛋白酶酶解

配制大豆7S蛋白溶液，調(diào)節(jié)各蛋白酶酶解最適溫度和最適pH，按照酶底比1∶50加入蛋白酶，酶解過(guò)程中保持pH穩(wěn)定。反應(yīng)10～120 min分別取樣，調(diào)pH至7.0，95℃水浴10 min滅酶，冰水冷卻，待用。

1.2.5 熱處理聯(lián)合胰蛋白酶酶解

將1.2.3中加熱后的大豆7S蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，溫度37℃，按照酶底比1∶50加入胰蛋白酶，酶解過(guò)程中保持pH穩(wěn)定。分別在反應(yīng)10、20、30、60、120 min時(shí)取樣，調(diào)節(jié)pH至7.0，95℃水浴10 min滅酶，冰水冷卻，待用。

1.2.6 熱處理聯(lián)合胃蛋白酶酶解

將1.2.3中加熱后的大豆7S蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至1.5，溫度37℃，按照酶底比1∶50加入胃蛋白酶，酶解過(guò)程中保持pH穩(wěn)定[12]。分別在反應(yīng)30、60、120 min時(shí)取樣，調(diào)節(jié)pH至7.0，95℃水浴10 min滅酶，冰水冷卻，待用。

1.2.7 SDS-PAGE

將大豆7S蛋白和酶解后的大豆7S蛋白酶解液分別用純水稀釋至蛋白質(zhì)含量0.4%，與等量的蛋白質(zhì)溶解液、0.1%溴酚藍(lán)、0.3%DTT混合，于100℃加熱10 min。凝膠電泳以電壓260 V、電流13 mA運(yùn)行2 h，取出膠條，浸泡于固定液(7%乙酸，40%甲醇)中1 h，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色至少2 h，然后于去離子水中脫色至背景清晰[13-14]。

1.2.8 質(zhì)譜鑒定抗消化肽段

采用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大豆7S蛋白酶解物中的抗消化肽段進(jìn)行鑒定。用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF)進(jìn)行測(cè)試，F(xiàn)lex Analysis和Bio tools軟件進(jìn)行分析。肽段由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)匹配[15]。

1.2.9 ELISA法分析抗原性

按照β-伴大豆球蛋白定量檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)試劑盒提供的線性范圍，將處理好的樣品用樣品稀釋液稀釋一定的倍數(shù)，96孔酶標(biāo)板加入50 μL/孔稀釋樣，再加入50 μL/孔的抗體工作液，輕輕晃勻，37℃溫育30 min；棄液，加洗滌液300 μL/孔，保持10 s，洗滌4次，用吸水紙拍干；加入HPR標(biāo)記二抗100 μL/孔，37℃溫育30 min；同上洗滌、拍干后，加入混好的顯色液100 μL/孔，37℃溫育15 min，最后加入終止液50 μL/孔，輕晃混勻后，立即于酶標(biāo)儀450/630 nm讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算過(guò)敏原含量。以抗原性降低率表示各處理方法降低抗原的效果，按下式計(jì)算。

抗原性降低率=(對(duì)照組的過(guò)敏原含量-酶解物中的過(guò)敏原含量)/對(duì)照組中的過(guò)敏原含量×100%

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

采用Image Lab軟件分析SDS-PAGE圖譜；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均取3次測(cè)得的平均值，采用SPSS軟件分析其差異性，P< 0.05表示差異顯著；采用Excel、Origin8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布及抗原性變化

2.1.1 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的SDS-PAGE分析(見(jiàn)圖1)

注：M為Marker；0為未經(jīng)任何處理的大豆7S蛋白；圖(a)的1～5為未經(jīng)加熱預(yù)處理的大豆7S蛋白分別酶解10、20、30、60、120 min；圖(b)、(c)、(d)中1～5為加熱預(yù)處理10 min后再分別酶解10、20、30、60、120 min；1′～5′為加熱預(yù)處理20 min后再分別酶解10、20、30、60、120 min。圖1 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胰蛋白酶酶解物的SDS-PAGE譜圖

實(shí)驗(yàn)室制備的大豆7S蛋白的蛋白質(zhì)含量為91.18%。由圖1(a)可知，條帶0經(jīng)Image Lab分析可得大豆7S/11S蛋白的比值為2.97，與吳超[16]的結(jié)果一致。胰蛋白酶能專一性地酶解由精氨酸、賴氨酸的羧基端形成的肽鍵。隨著胰蛋白酶酶解，未經(jīng)加熱預(yù)處理的大豆7S蛋白的α′亞基快速降解，α亞基呈規(guī)律性地被降解，直至120 min時(shí)完全消失，而β亞基則表現(xiàn)出較高的消化穩(wěn)定性，這與王錦欣等[17]的結(jié)論基本一致。此時(shí)產(chǎn)生的新條帶質(zhì)譜鑒定結(jié)果如表1所示。由表1可知，在50～75 kDa之間產(chǎn)生的一些新條帶主要來(lái)自α′亞基和α亞基，在20～25 kDa之間產(chǎn)生的一些新的條帶主要為sucrose-binding protein-like(d)、α′亞基(e)及β亞基(f)，且在β亞基位置出現(xiàn)降解的α亞基(c)。

表1 胰蛋白酶酶解物的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

從圖1(b)可知，與圖1(a)相比，α′亞基依然很快被降解至消失，而α、β亞基的降解程度均加大，且主要產(chǎn)生20～25 kDa間的條帶，以及15 kDa下的小分子肽段。70℃加熱預(yù)處理10 min和20 min再酶解的電泳圖譜差異不大，說(shuō)明兩種預(yù)處理方式導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)程度相近。由圖1(c)可知，由于大豆7S蛋白變性溫度接近80℃[18]，當(dāng)酶解10 min時(shí)，α′、α及β亞基基本都被降解, 只產(chǎn)生約25 kDa的新條帶。由圖1(d)可知，蛋白降解情況與圖1(c)基本一致，且在酶解60、120 min時(shí)，靠近25 kDa的新條帶灰度有所減弱，逐漸出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約20 kDa的新條帶，大量酶解小肽都集中在15 kDa以下。

2.1.2 胰蛋白酶酶解大豆7S蛋白的抗原性變化(見(jiàn)圖2)

由圖2(a)可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，β-伴大豆球蛋白的抗原性顯著降低(P<0.05)，在酶解120 min后，抗原性降低率約為40%。從電泳圖上看，可能與殘留的β亞基以及產(chǎn)生的來(lái)源于α′、α亞基的酶解肽鏈有關(guān)。

與未經(jīng)加熱預(yù)處理的樣品相比，70℃加熱預(yù)處理后，隨著胰蛋白酶酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，盡管電泳譜圖中圖1(a)和圖1(b)相差較大，但對(duì)于抗原性的影響趨勢(shì)及降低率相似。由圖2(b)可知，樣品經(jīng)過(guò)80℃或90℃加熱預(yù)處理后，再進(jìn)行胰蛋白酶酶解，其抗原性降低程度顯著增大(P<0.05)，最高可達(dá)79.99%。推測(cè)可能是加熱導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露更多內(nèi)部的酶催化位點(diǎn)，故酶解效果較好，同時(shí)導(dǎo)致部分暴露的抗原表位被破壞。

注：圖(b)中1～5為70℃加熱預(yù)處理后，分別酶解10、20、30、60、120 min；6～10為80℃加熱預(yù)處理后，分別酶解10、20、30、60、120 min；11～15為90℃加熱預(yù)處理后，分別酶解10、20、30、60、120 min。圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胰蛋白酶酶解物的抗原性降低率

2.2 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布及抗原性變化

2.2.1 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的SDS-PAGE分析(見(jiàn)圖3)

與胰蛋白酶的酶解位點(diǎn)不同，胃蛋白酶主要酶解由芳香族氨基酸及其他疏水性氨基酸形成的肽鍵。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的酶解時(shí)間分別選取30、60 min和120 min進(jìn)行考察。由圖3(a)可知，未經(jīng)加熱預(yù)處理大豆7S蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解30～120 min后，α′、α亞基略微被降解，而β亞基的灰度逐漸增加，且50～75 kDa之間也產(chǎn)生一條逐漸加深的新條帶，同時(shí)大豆7S蛋白中含有的11S的A、B肽鏈優(yōu)先被酶解，這與趙謀明[12]、劉曉毅[19]等的研究結(jié)果一致。由圖3(b)可知，在70℃下加熱10 min及20 min后再酶解，α′、α及β亞基均大幅度降低，且與胰蛋白酶酶解情況相同的是均產(chǎn)生25 kDa附近的新條帶；同樣，由圖3(c)、(d)可知，在80、90℃下酶解60 min后，α′、α及β亞基基本消失，且均產(chǎn)生位置集中在20 kDa以下的小分子肽段。綜上所述，經(jīng)過(guò)加熱預(yù)處理后，采用胃蛋白酶酶解，大豆7S蛋白的3種亞基在電泳譜圖中的條帶很快消失，同時(shí)在37 kDa以下出現(xiàn)大量不同相對(duì)分子質(zhì)量的肽鏈，這些肽鏈主要為致敏條帶α′、α及β亞基的酶解產(chǎn)物。

注：M為Marker；0為未經(jīng)任何處理的大豆7S蛋白；圖(a)的1～3為未經(jīng)加熱預(yù)處理的大豆7S蛋白分別酶解30、60、120 min；圖(b)、(c)、(d)1～3為加熱預(yù)處理10 min后再分別酶解30、60、120 min；1′～3′為加熱預(yù)處理20 min后再分別酶解30、60、120 min。圖3 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胃蛋白酶酶解物的SDS-PAGE譜圖

2.2.2 胃蛋白酶酶解大豆7S蛋白的抗原性變化(見(jiàn)圖4)

由圖4(a)可知，胃蛋白酶酶解物的抗原性降低率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，抗原性降低率為3.8%～4.5%。因?yàn)槠渲饕旅舻鞍爪痢?、α及β亞基降解程度不大，?dǎo)致還存在大量的抗原表位。

由圖4(b)可知，在相同酶解條件下，不同的加熱預(yù)處理時(shí)間(10、20 min)對(duì)酶解物的抗原性的影響較??；同時(shí)，結(jié)合圖3發(fā)現(xiàn)酶解物中肽鏈組成基本一致。在相同的加熱預(yù)處理時(shí)間下，隨著加熱預(yù)處理溫度升高，酶解物的抗原性降低率總體呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。70℃加熱預(yù)處理10 min后，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，其抗原性降低率從10%逐漸增大到37%左右，結(jié)合相應(yīng)電泳譜圖，推測(cè)可能是α′、α及β亞基大幅度降解導(dǎo)致的。80℃加熱預(yù)處理?xiàng)l件下， 抗原性降低率從20%顯著增加到約50%(P< 0.05)，此時(shí)α′、α亞基基本消失，導(dǎo)致內(nèi)部部分抗原表位暴露，從而被破壞，進(jìn)而抗原性大大降低。90℃加熱預(yù)處理?xiàng)l件下，條帶的變化情況與80℃類似，但是ELISA的結(jié)果顯示，酶解30 min后抗原性降低率約為20%，而酶解120 min后抗原性降低率約為10%。推測(cè)這可能與產(chǎn)生的新肽段的聚集有關(guān)，即雖然線性表位被破壞，但卻出現(xiàn)新的構(gòu)象表位，從而導(dǎo)致抗原性增加。

綜上，加熱預(yù)處理可以促進(jìn)蛋白酶對(duì)大豆7S蛋白的酶解，且更大程度地降低抗原性；經(jīng)過(guò)80℃或90℃加熱預(yù)處理后，再進(jìn)行胰蛋白酶酶解，其抗原性降低程度明顯增大，最高可達(dá)79.99%；加熱預(yù)處理后再經(jīng)胃蛋白酶酶解，其抗原性降低率最大可達(dá)50.4%。

注：圖(b)中1～3為70℃加熱預(yù)處理后，分別酶解30、60、120 min；4～6為80℃加熱預(yù)處理后，分別酶解30、60、120 min；7～9 為90℃加熱預(yù)處理后，分別酶解30、60、120 min。圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 不同酶解條件下制備的大豆7S蛋白胃蛋白酶酶解物的抗原性降低率

2.3 抗消化肽段的鑒定(見(jiàn)圖5)

注：M為 Marker；1為大豆7S蛋白；2為80℃加熱預(yù)處理10 min后，胰蛋白酶酶解10 min；3為80℃加熱預(yù)處理10 min后，胃蛋白酶酶解10 min。圖5 胰蛋白酶、胃蛋白酶的酶解物抗消化肽段的SDS-PAGE譜圖

結(jié)合兩種酶解方式的電泳結(jié)果以及抗原性來(lái)看，胰蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物仍具有一定的抗原性，雖然胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解位點(diǎn)不同，但是均在加熱預(yù)處理再酶解后產(chǎn)生相同位置的新條帶，推測(cè)可能是殘留的抗消化肽段(20～25 kDa)引起的(圖5中的I 、II)。為了確定這兩種酶解條件下的新條帶的相關(guān)信息，采用質(zhì)譜鑒定抗消化肽段，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，這兩種酶解條件下的新條帶均來(lái)源于β-伴大豆球蛋白的α亞基，發(fā)現(xiàn)雖然兩種酶酶解位點(diǎn)不同，但產(chǎn)生的抗消化肽段來(lái)源相同，且α亞基是國(guó)際公認(rèn)的致敏蛋白之一[20]，這解釋了為何酶解后還存在致敏性。大豆過(guò)敏屬于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)[21]，致敏原要保持完整的抗原決定簇才有致敏的可能性。

表2 抗消化肽段的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究表明，加熱和酶解聯(lián)合處理能夠顯著增大β-伴大豆球蛋白的降解程度，β亞基消化程度得到極大提升，α亞基、α′亞基幾乎完全被降解，在相同酶解時(shí)間下，胰蛋白酶的酶解速度快于胃蛋白酶。同時(shí)，加熱和酶解聯(lián)合處理能夠有效地降低大豆7S蛋白的抗原性。單獨(dú)加熱處理，僅可使得蛋白結(jié)構(gòu)松散，更多的酶解位點(diǎn)得到暴露，引起過(guò)敏反應(yīng)的構(gòu)象表位得到一定的破壞。而加熱聯(lián)合酶解處理能夠大幅度降低β-伴大豆球蛋白的抗原性，蛋白展開(kāi)的結(jié)構(gòu)暴露的抗原表位更利于蛋白酶的破壞，其中胰蛋白酶的酶解效果優(yōu)于胃蛋白酶，經(jīng)80℃加熱預(yù)處理10 min再經(jīng)胰蛋白酶處理，大豆7S蛋白的抗原性降低了79.99%，而胃蛋白酶酶解條件下最多只降低了50.4%。另外，胰蛋白酶和胃蛋白酶經(jīng)過(guò)加熱預(yù)處理后再酶解，產(chǎn)生的相同相對(duì)分子質(zhì)量位置的新條帶，經(jīng)蛋白鑒定后，均來(lái)自于β-伴大豆球蛋白的α亞基，為國(guó)際公認(rèn)的致敏蛋白之一。此結(jié)果可為脫敏食品的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。