張 波 蘇衍華 龐麗艷 陳章良 李兆樓 王鳳琴Δ

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067;2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826 ；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,濟(jì)寧 272013)

凝膠是介于固體和液體之間的一種物質(zhì)，天然多糖構(gòu)筑的水凝膠，以非共價(jià)鍵結(jié)合，在人體內(nèi)容易降解和分解，能夠吸附、裝載、釋放藥物[1]。凝膠良好的物理性質(zhì)和生物相容性為其作為緩釋、控釋制劑載體提供了巨大的應(yīng)用前景[2-3]。卡拉膠(Kappa-Carrageenan，KC)、瓊脂(Agar)和羥丙基-β-環(huán)糊精(Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin,HP-β-CD)屬無(wú)毒物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、衛(wèi)生等領(lǐng)域。目前KC和Agar應(yīng)用于藥物載體的研究較少。KC和Agar能夠產(chǎn)生協(xié)同增效作用，分子之間能夠形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)嘗試合成了KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠。

甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX )又稱為氨甲喋呤，是一種葉酸類抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于兒童白血病及淋巴癌等惡性腫瘤，但是用量達(dá)到一定程度時(shí)對(duì)骨髓、肝細(xì)胞有毒副作用[4]，因此研發(fā)以復(fù)合凝膠為輔料的新型甲氨蝶呤藥物制劑具有重要的意義。本文對(duì)KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠作為甲氨蝶呤載體進(jìn)行了初步研究，探討了其微結(jié)構(gòu)、包封率及其釋放行為。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

KC(化學(xué)純，安徽酷爾有限公司)；Agar(生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；HP-β-CD(生化試劑，上海源葉生物科技有限公司)；MTX(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)100187-200602)；MTX原料藥(湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司)；透析袋(截留分子量1000，北京索萊寶科技有限公司)；掃描電子顯微鏡(FESEM，德國(guó)蔡司公司)；島津IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀；島津UV-2450/2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；SDT-Q600 V8.3 Build 101 (USA)熱分析儀；German Bruker/D8ADVANCE X射線衍射儀；智能溶出試驗(yàn)儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠)等。

1.2 凝膠的制備

稱取0.2369g KC，0.0789g Agar，0.056g HP-β-CD放入比色管中，然后加蒸餾水6ml，超聲1min，于55℃下恒溫?cái)嚢?0min，繼續(xù)恒溫?cái)嚢柚敝帘壬苤心z形成，靜置得鮮凝膠。對(duì)比實(shí)驗(yàn)的凝膠，不加HP-β-CD，按上述方法制備。將上述所得的鮮凝膠，置于真空干燥箱(溫度40℃)中干燥24h，得到干凝膠。

1.3 凝膠結(jié)構(gòu)觀察

用光學(xué)顯微鏡觀察所得凝膠樣品的結(jié)構(gòu)形貌，并拍照記錄典型形貌。將干燥所得的干凝膠進(jìn)行噴金，并用電子掃描顯微鏡觀察干凝膠的結(jié)構(gòu)和形貌得到電子顯微鏡圖片。

1.4 凝膠的流變學(xué)分析

采用Thermo Haake RS300流變儀的堆板系統(tǒng)(直徑35mm，間隙0.105mm)測(cè)定各凝膠樣品的流變學(xué)性能。

1.5 紅外光譜分析

采用島津IRAffinity-1S傅里葉變換紅外光譜儀，KBr壓片法，獲得干凝膠紅外光譜圖。

1.6 X光粉末衍射法(XRD)

將干凝膠樣品置于樣品池，采用German Bruker/D8ADVANCE X射線衍射儀掃描記錄譜圖。

1.7 載藥凝膠的制備

1.7.1MTX載藥凝膠的制備 稱取HP-β-CD 0.0957g、MTX 0.0318g(凝膠總質(zhì)量的5‰)，配制HP-β-CD與藥物的包合溶液，并避光放置24h。稱取0.2369g KC、0.0789g Agar，加上述包合溶液6ml于比色管中，超聲1min，在45℃下恒溫?cái)嚢?0min，繼續(xù)恒溫?cái)嚢柚敝帘壬苤心z形成，于黑暗陰涼處?kù)o置得MTX載藥凝膠。對(duì)比實(shí)驗(yàn)的藥物凝膠，不加HP-β-CD，按上述方法制備。

1.7.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取5.0mg MTX標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.01mol/L的氫氧化鈉溶液，轉(zhuǎn)置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L的氫氧化鈉溶液定容。分別取上述溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L的氫氧化鈉溶液定容，得其濃度分別為4、8、12、16和20μg/ml。以0.01mol/L的氫氧化鈉溶液作空白對(duì)照，在303nm處測(cè)定其吸光度，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，MTX溶液的濃度C (μg/ml)與吸光度A之間存在良好的線性關(guān)系,其回歸方程為：Y=0.05397C-0.00307，R2=0.9999[5]。見(jiàn)圖1。

1.7.3包封率測(cè)定 取PBS緩沖液75ml于100ml小燒杯中，稱取1.0g載藥凝膠裝入處理過(guò)的透析袋中，然后放置于PBS緩沖液中透析24h。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度(MTX為303nm)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包封率：EE%=(C總-C游離)/C總×100%。

圖1 甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.7.4體外釋放實(shí)驗(yàn) 稱取1.0g載藥凝膠，放入準(zhǔn)備好的透析袋中，然后放入裝有模擬人體胃液或模擬人體腸液的智能溶出儀中，設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)速為60r/min，模擬人體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。24h內(nèi)每隔一小時(shí)取同體積相同溫度的模擬液，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上在303nm測(cè)量吸光度，描繪釋藥曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶膠與凝膠相變過(guò)程

使用溶膠-凝膠法制備KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠，經(jīng)過(guò)了一個(gè)相轉(zhuǎn)變過(guò)程。該體系的溶膠，在70℃恒溫和磁力攪拌條件下，恒溫后形成了白色的凝膠。凝膠形成的最低總濃度為2%，凝膠濃度為5%(KC/Agar)，添加HP-β-CD后，三者比例為4∶1.5∶1。如果加入MTX(載藥量為5‰)，在35℃～55℃加熱攪拌條件下形成亮黃色的MTX載藥凝膠。

2.2 凝膠的微觀形貌

通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡可以觀察到KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠的微觀形貌(圖2)。在圖2的A和B是KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠的光學(xué)顯微鏡照片，其中難以觀察到復(fù)合凝膠的結(jié)構(gòu)，這是由于凝膠飽吸水分子，凝膠表面漲成平面，導(dǎo)致表面平滑。為了進(jìn)一步探究凝膠的微觀形貌，用干凝膠獲得了復(fù)合凝膠的SEM掃描(圖2C和2D)。去除溶劑之后，復(fù)配干凝膠樣品微結(jié)構(gòu)具有許多孔洞，這些孔洞可以包裹、吸附裝載藥物分子，實(shí)現(xiàn)控制藥物的釋放[6]。

2.3 凝膠的流變學(xué)性質(zhì)

KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠的力學(xué)機(jī)械性能，可以通過(guò)流變測(cè)量來(lái)描述。復(fù)合凝膠樣品在流變測(cè)量(圖3a和3b) 中提供儲(chǔ)能模量(G’)和耗能模量(G”)。如圖3a在掃描頻率測(cè)試中，在1Pa的外加應(yīng)力條件下，樣品的G’和G”是保持基本不變的；隨著掃描頻率越來(lái)越大，G’>G”且在整個(gè)頻率中是基本保持不變的。在振幅掃描測(cè)試中，復(fù)合凝膠的彈性模量可達(dá)104Pa左右，說(shuō)明這復(fù)合凝膠足夠強(qiáng)勁、富有彈性。當(dāng)外加應(yīng)力在100Pa時(shí)復(fù)合凝膠體系出現(xiàn)了屈服點(diǎn)(3b)，說(shuō)明該凝膠具有一定的韌性[7-8]。

注：A&B.KC/Agar/HP-β-CD鮮凝膠(5wt%)光學(xué)顯微鏡圖；C&D.KC/Agar/HP-β-CD干凝膠(5wt%)掃描電鏡圖

圖3 KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠的(5wt%)動(dòng)態(tài)流變圖

2.4 紅外光譜分析及凝膠微結(jié)構(gòu)

復(fù)合凝膠的紅外光譜反映出凝膠內(nèi)部分子的官能團(tuán)之間的相互作用力(圖4)。Agar(圖4c)和KC(圖4b)原料分子分別在3344cm-1和3385cm-1的紅外吸收峰被歸屬為O-H鍵的伸縮振動(dòng)[9]，而在干凝膠中移至到3415cm-1(圖4a)吸收峰。此處發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象，這是因?yàn)榘l(fā)生氫鍵相互作用。圖4d所示，吸收峰3394cm-1由原料HP-β-CD的O-H伸縮振動(dòng)引起的，然而，一旦HP-β-CD組裝到復(fù)合凝膠中，就會(huì)出現(xiàn)峰值移動(dòng)至3415cm-1(圖4a)，這是O-H形成氫鍵造成的結(jié)果。純HP-β-CD的糖環(huán)1155cm-1(圖4d)的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，卻在干凝膠樣品中移動(dòng)到了1159cm-1(圖4a)的吸收位置，這是由C-O耦合拉伸振動(dòng)引起的。所以，復(fù)合凝膠內(nèi)部的分子之間主要存在著氫鍵作用力，這也說(shuō)明了復(fù)合凝膠并沒(méi)有發(fā)生化學(xué)變化，只是一個(gè)物理交聯(lián)過(guò)程。

注：a.KC/Agar/HP-β-CD干凝膠(5wt%)； b.KC原料；c.Agar原料；d.HP-β-CD

2.5 X射線粉末衍射(XRD)譜圖

XRD圖譜也可以反映出復(fù)合凝膠內(nèi)部分子的結(jié)構(gòu)信息(圖5)。Agar原料(圖5c)在2θ=19.8°有一個(gè)寬泛的峰值，沒(méi)有尖銳或者狹窄的峰值，表明它是無(wú)定形狀態(tài)[10]。KC原料(圖5d)在2θ=27.9°有一個(gè)明顯的尖峰，表明有晶體結(jié)構(gòu)的存在，而KC本身是非晶體結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)镵C原料的雜質(zhì)晶體無(wú)機(jī)鹽如氯化鉀造成的[11]。HP-β-CD(圖5b)在2θ=18.8°也只有一個(gè)寬泛的峰存在，它也是一個(gè)非晶形結(jié)構(gòu)。但是，三者合成復(fù)合凝膠(圖5a)后，也只在2θ=20.05°有一個(gè)廣泛的峰且尖銳的峰消失(無(wú)機(jī)鹽分解)，說(shuō)明合成的復(fù)合凝膠無(wú)定形結(jié)構(gòu)，三種原料分子充分結(jié)合、相互作用形成了一定結(jié)構(gòu)的復(fù)合凝膠體系。

2.6 載藥凝膠的包封率

包封率反映凝膠對(duì)藥物的裝載及包裹情況[12]。實(shí)驗(yàn)表明，含有羥丙基-β-環(huán)糊精的復(fù)合凝膠體系包封率達(dá)到50.29%；若不加羥丙基-β-環(huán)糊精，則凝膠的包封率只是14.9%。這說(shuō)明加入羥丙基-β-環(huán)糊精后，羥丙基-β-環(huán)糊精與藥物分子之間具有主客體包合作用，對(duì)藥物的緩控釋作用更強(qiáng)，提高了載藥凝膠的包封率(表1)。

注：a.KC/Agar/HP-β-CD干凝膠(5wt%)；b.HP-β-CD；c.Agar原料；d.KC原料

表1 載藥凝膠包封率

2.7 載藥凝膠的體外釋放

2.7.1體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果 體外釋放實(shí)驗(yàn)可反映復(fù)合凝膠對(duì)藥物控制釋放的能力。在模擬人體腸液中(圖6)，不加HP-β-CD的MTX載藥凝膠(圖6a)在5h之內(nèi)基本上達(dá)到釋放溶解平衡，累積釋放藥物69%；而加入HP-β-CD的MTX載藥凝膠(圖6b)大約需要10h才達(dá)到釋放溶解平衡，累積釋放藥物62%。加入HP-β-CD后，載藥凝膠釋藥率降低約7%，說(shuō)明在凝膠體系中加入HP-β-CD后，復(fù)合凝膠對(duì)藥物的釋放控制得更有效[13]。同樣，在模擬人體胃液中(圖7)，不加HP-β-CD的MTX載藥凝膠(圖7a)在6h之內(nèi)基本上達(dá)到釋放溶解平衡，累積釋放藥物82%；而加入HP-β-CD的MTX載藥凝膠(圖7b)大約需要11h才達(dá)到釋放溶解平衡，累積釋放藥物73%。加入HP-β-CD后，載藥凝膠釋藥率降低約9%，仍然說(shuō)明HP-β-CD在凝膠體系中對(duì)藥物的釋放控制更有效果。因此，不論是在模擬人體腸液，還是模擬人體胃液中，KC和Agar等多糖為主的凝膠體系，加入HP-β-CD后顯示了主體功能分子的主客體作用，能夠更好地控制藥物釋放效果。

注：a.KC/Agar/MTX凝膠(5wt%)；b.HP-β-CD/KC/Agar/MTX凝膠(5wt%)

注：a.KC/Agar/MTX凝膠(5wt%)； b.HP-β-CD/KC/Agar/MTX凝膠(5wt%)

2.7.2復(fù)合凝膠微結(jié)構(gòu) 依據(jù)上述數(shù)據(jù)，對(duì)KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，k-KC為粗分子繩和細(xì)分子繩的混合(粗分子繩為大量的螺旋結(jié)構(gòu)混合在一起，細(xì)繩為未螺旋排布的分子鏈)，可知KC主要是以螺旋形式存在。Agar和KC都是由半乳糖的衍生物構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖，不同的是，在Agar中D-半乳糖(1→3)和L-半乳糖衍生物(1→4)相交替，而KC都是D-型的半乳糖或其衍生物的交替共聚物[14]。兩者的分子結(jié)構(gòu)一個(gè)是左旋的，一個(gè)是右旋的。當(dāng)Agar和KC結(jié)合時(shí)，兩者分別形成鏈網(wǎng)絡(luò)，兩個(gè)鏈網(wǎng)絡(luò)相互貫穿，且存在一些物理接觸點(diǎn)[15]。包裹藥物的HP-β-CD分子分散在凝膠網(wǎng)絡(luò)體系中，對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用，加強(qiáng)了網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)中氫鍵的形成，有利于凝膠的形成，少量的HP-β-CD可嵌入凝膠骨架之中，穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[16-17]。

藥物能夠均勻分布于凝膠基質(zhì)中，釋藥速率由藥物通過(guò)高分子基質(zhì)的擴(kuò)散來(lái)控制。MTX一部分直接分布在凝膠基質(zhì)中，另一部分以HP-β-CD包合物被分布在凝膠基質(zhì)中。藥物的釋藥量隨藥物擴(kuò)散到凝膠表面距離的增加而下降[18]，隨時(shí)間的增加而減少。凝膠內(nèi)部藥物首先擴(kuò)散到凝膠表面，然后才能順利被釋放。

3 結(jié)論

采用溶膠-凝膠法合成了KC/Agar/HP-β-CD復(fù)合凝膠。該復(fù)合凝膠是一種良好的藥物載體，所載抗癌藥甲氨蝶呤與HP-β-CD形成了穩(wěn)定的包合物，包載于復(fù)合凝膠體系中，使得甲氨蝶呤具有較為緩慢的釋放速率，可以明顯延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間[19]。