徐鵬飛 楊艷紅 張毓婷 陳 云 湯定欽

(浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

毛竹(Phyllostachysedulis)是一種大型的多年生常綠散生竹類，具有生長(zhǎng)快、繁殖強(qiáng)、成材早、用途廣、投資少收益大等特點(diǎn)。據(jù)全國(guó)第八次森林資源清查統(tǒng)計(jì)(國(guó)家林業(yè)局， 2014)，目前我國(guó)竹林面積601萬(wàn)hm2，其中毛竹林443萬(wàn)hm2，毛竹在竹林面積中所占比例巨大。在針對(duì)毛竹的研究中，遺傳育種是相對(duì)薄弱的環(huán)節(jié)，原因在于毛竹開花間隔周期長(zhǎng)達(dá)60年以上，期間以無(wú)性繁育構(gòu)建了克隆群體，這限制了人們對(duì)其遺傳基礎(chǔ)的研究，難以進(jìn)行選擇、雜交育種等多世代的遺傳改良。我國(guó)毛竹林在世界竹業(yè)發(fā)展中占據(jù)重要地位，發(fā)展毛竹林是發(fā)展林業(yè)的重大措施，隨著我國(guó)竹產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，竹子資源利用還面臨不少問題，其中最為突出的是新品種的缺乏，無(wú)法滿足竹產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需求。

多倍化對(duì)植物進(jìn)化與新物種形成具有重要的意義，是選育新品種的重要手段之一。研究結(jié)果表明： 多倍體植株是由于染色體的加倍而成，其根、莖、葉、花、果實(shí)等多表現(xiàn)出增大、活性成分含量提高，植株抗逆性增強(qiáng)等顯著特征。藥用植物杭白芷(Angelicadahurica) 多倍體含有的歐前胡素比正常植株高2倍(彭菲等， 2002)； 白術(shù)(Atractylodesmacrocephala) 四倍體過氧化物含量比二倍體植株明顯增加(程心文等， 2003)； 甜葉菊(Steviarebaudiana) 四倍體葉片中糖甙含量比二倍體增加4.9%(陳紹潘，1995)； 四倍體西瓜(Citrulluslanatus) 耐鹽性明顯比二倍體強(qiáng)(劉文革等， 2002)； 四倍體青菜(Brassicachinensis) 的耐熱性要高于二倍體植株(張建軍等，1998)。迄今竹子多倍體的誘導(dǎo)僅見通過流式細(xì)胞儀等方法在花藥離體培養(yǎng)中鑒定出了叢生竹種麻竹(Dendrocalamuslatiflorus) 六倍體、十二倍體植株(李海營(yíng)等， 2011)，散生竹未見報(bào)道。

植物多倍體人工誘導(dǎo)方法可分為物理誘導(dǎo)與化學(xué)誘導(dǎo)。物理誘導(dǎo)方法由于誘導(dǎo)率低、效果不穩(wěn)定等因素已逐漸不被采用(陶抵輝等， 2007)。常用于化學(xué)誘導(dǎo)的試劑有各種植物堿、麻醉劑、生長(zhǎng)劑、激動(dòng)素、抗生素等，其中秋水仙素是誘變多倍體效果最好的藥劑之一(彭靜等， 2010)，常見的誘導(dǎo)法有浸泡法、滴液法和混培法等(杜艷偉等， 2011)。秋水仙素抑制了細(xì)胞有絲分裂時(shí)期紡綞絲的合成，因而在其后期染色單體分裂時(shí)沒有紡綞絲向細(xì)胞兩極牽引而不能形成細(xì)胞板，細(xì)胞不分裂就形成了染色體加倍的細(xì)胞(Soltisetal.， 1989)。因此，利用秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體多選擇處理有絲分裂的細(xì)胞，如莖尖、根尖、幼葉、頂芽等這些分裂最旺盛的植物組織(Wuetal., 2015)，其中種子誘導(dǎo)率和存活率均顯著高于莖尖和愈傷組織(Ainaetal., 2012)。研究表明： 0.5 g·L-1的秋水仙素水溶液浸漬甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)種子12 h，誘導(dǎo)率達(dá)到23.0%(莫官站等， 2010)，1 g·L-1的秋水仙素溶液浸漬萌動(dòng)的有斑百合(Liliumconcolorvar.pulchellum)種子，誘導(dǎo)率高達(dá)44.4%(張錫慶等， 2017)。

本研究以毛竹種子為材料，研究不同秋水仙素濃度及時(shí)間處理對(duì)毛竹染色體加倍的效果，并觀察毛竹多倍體早期的性狀表現(xiàn)，以期建立一套高效的毛竹多倍體誘導(dǎo)及快速、準(zhǔn)確的倍性鑒定方法，為毛竹新品種選育提供優(yōu)新種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及預(yù)處理

毛竹種子于2017年9月采自廣西壯族自治區(qū)靈川縣同一母株，半同胞種子在其種胚完成發(fā)育、后熟后采收。在不傷害到胚的前提下剝?nèi)シN殼，篩選出發(fā)育飽滿的種子。在超凈工作臺(tái)中利用70%(V/V)的乙醇種子表面消毒30 s、無(wú)菌水漂洗3次，再用2%(V/V)次氯酸鈉溶液浸泡種子10 min、無(wú)菌水漂洗3次后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的GA20溶液浸泡種子24 h進(jìn)行催芽。

1.2 多倍體誘導(dǎo)方法

經(jīng)預(yù)處理的毛竹種子，分別用質(zhì)量濃度0.1、0.5、1、2 g·L-1的秋水仙素(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶液誘導(dǎo)處理24、48、72 h，無(wú)菌水為空白對(duì)照，每組處理30粒種子，各設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束后，用無(wú)菌水洗3～4次，濾紙擠干水分，接種到經(jīng)無(wú)菌處理的培養(yǎng)皿濾紙上培養(yǎng)。待種子露白，觀察記錄種子下胚部膨大情況后，再將露白的種子播種于土壤培養(yǎng)穴中。設(shè)置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為： 溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期12 h光照/12 h 黑暗。

1.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA相對(duì)含量

生物體的單倍體基因組所含 DNA 總量稱為C值。在植物學(xué)研究中，流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)可用于檢測(cè)植物細(xì)胞核DNA含量及其倍性水平，計(jì)算公式： 待測(cè)樣本核DNA含量或倍性水平=參照樣本核DNA含量或倍性水平×(待測(cè)樣本G0或G1熒光均值/參照樣本G0或G1熒光均值)(Dolezeletal., 2007)。

待毛竹幼苗長(zhǎng)至七葉一心期開始分蘗后，按CyStain UV Precise T 試劑盒(Sysmex Partec, 德國(guó))操作說明，在培養(yǎng)皿中加入450 μL的Nuclei Extraction Buffer，以剛抽出未展開的幼嫩葉片為材料，用刀片迅速切碎以保證細(xì)胞充分釋放，靜置3 min使其與細(xì)胞提取液充分結(jié)合后，加入1 800 μL染色液， 200目細(xì)胞篩過濾后，靜置5 min，在流式細(xì)胞儀(CYHOW PA，德國(guó)PARTEC)上進(jìn)行檢測(cè)，參數(shù)按常規(guī)的設(shè)定。其中，每株上母株和側(cè)枝的嫩葉都要測(cè)，并且每個(gè)樣重復(fù)測(cè)3次。測(cè)定每個(gè)樣品時(shí)，先用水稻‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)進(jìn)行校對(duì)后才開始測(cè)定； 同時(shí)每次的倍性篩選時(shí)選擇‘日本晴’和二倍體毛竹作為對(duì)照，以提高所得結(jié)果的可靠性。誘導(dǎo)率=多倍體植株數(shù)量/誘導(dǎo)處理種子數(shù)量。

1.4 氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞大小測(cè)定

待植株生長(zhǎng)6個(gè)月后，分別選取3株長(zhǎng)勢(shì)良好的四倍體與二倍體植株，截取與對(duì)照二倍體植株相同位置成熟葉片的中部，使用次氯酸離析法(張立榮等， 2009)制片，每個(gè)植株隨機(jī)選10個(gè)視野和10個(gè)氣孔拍照， 20倍物鏡下觀察統(tǒng)計(jì)。

1.5 光合作用的測(cè)定

待植株生長(zhǎng)8個(gè)月后，參照吳海燕等(2019)方法，于晴天9∶00—11∶00，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的3株二倍體與四倍體植株，然后每株選取從頂端起第3片成熟葉子，每個(gè)葉子采用LI-6400光合儀(Li-COR, 美國(guó))測(cè)定，重復(fù)3次，使用自然光，溫度(25± 2)℃。

1.6 植株形態(tài)測(cè)定

毛竹幼苗在培養(yǎng)穴中生長(zhǎng)30天后，將四倍體和二倍體毛竹幼苗煉苗移栽至大棚中,生長(zhǎng)60天后，分別選取長(zhǎng)勢(shì)健壯的四倍體和二倍體毛竹各5株，對(duì)株高、葉片大小等進(jìn)行觀察記錄。

葉長(zhǎng)(cm)： 葉片基部到葉尖的長(zhǎng)度，測(cè)量每株竹苗從頂端起的第3個(gè)成熟葉片。

葉寬(cm)： 葉片最寬部分的橫向長(zhǎng)度，測(cè)量每株竹苗從頂端起的第3個(gè)成熟葉片。

株高(cm)： 母株頂端到地面的距離。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同倍性毛竹植株流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.1 多倍體植株的鑒定

由于植物多倍體中的細(xì)胞含有倍增的染色體數(shù)，其細(xì)胞中的總DNA含量也相應(yīng)地倍增,通過流式細(xì)胞儀可以較為簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)多倍體的鑒定。首先從已知的水稻的C值數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ricedata.cn/variety/)查得‘日本晴’DNA含量為2C=1 pg，而后利用公式計(jì)算待測(cè)樣品的C值=(待測(cè)樣品的平均峰值÷‘日本晴’水稻的平均峰值)×1 pg。由圖1可知，水稻‘日本晴’的DNA含量峰值位于13道的位置左右，二倍體毛竹DNA含量其峰值約為50道,四倍體植株的DNA含量峰值位于100道的位置左右，說明誘導(dǎo)得到的植株細(xì)胞核DNA含量有成倍增加，通過C值的換算公式，可以確定為四倍體。如果DNA含量在50與100道處都有峰值，則表明植株為混倍體(王麗艷等， 2004； 張虹等， 2017)。分別用0.1、0.5、1、2 g·L-14種不同濃度的秋水仙素溶液浸泡經(jīng)預(yù)處理的毛竹種子24、48和72 h后，誘導(dǎo)結(jié)果見表1。誘導(dǎo)處理1 080粒毛竹種子，栽培后共得到204株植株，其中具有下胚軸膨大現(xiàn)象的種苗有92株(圖2)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)倍性，除去出現(xiàn)雙峰的混倍體植株，共獲得15株四倍體植株。由表1可知，當(dāng)秋水仙素濃度為0.5 g·L-1、處理時(shí)間為72 h，及秋水仙素濃度為1 g·L-1、處理時(shí)間為24 h時(shí)，四倍體的誘導(dǎo)率分別達(dá)4.44%和5.56%，誘導(dǎo)效果最佳。而用低于0.1 g·L-1濃度的秋水仙素處理種子時(shí)無(wú)明顯誘導(dǎo)效果，說明誘導(dǎo)毛竹多倍體需要一定的秋水仙素濃度。當(dāng)秋水仙素濃度≥2 g·L-1，隨著浸泡作用時(shí)間增長(zhǎng)，植株的存活率及多倍體誘導(dǎo)率都明顯下降。

表1 不同秋水仙素處理組合對(duì)毛竹種子四倍體誘導(dǎo)的影響①

圖2 經(jīng)秋水仙素處理后毛竹種子生長(zhǎng)期下胚軸膨大現(xiàn)象

2.2 葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小及密度觀察

已有的研究結(jié)果表明，氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的大小和葉綠體數(shù)目與倍性成顯著正相關(guān)，氣孔密度與倍性成顯著負(fù)相關(guān)(張紅亮等， 2012)。經(jīng)過觀察對(duì)比發(fā)現(xiàn)(表2，圖3)，誘導(dǎo)成的四倍體毛竹的葉下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞顯著大于二倍體植株(P<0.05)，并且葉下表皮氣孔密度顯著小于二倍體植株(P<0.05)。這也從細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的角度證實(shí)了誘導(dǎo)的四倍體植株的真實(shí)性。

表2 毛竹二倍體與四倍體植株氣孔大小及密度的比較

圖3 毛竹二倍體與四倍體氣孔保衛(wèi)細(xì)胞

2.3 不同倍性毛竹光合速率的差異

毛竹四倍體植株的光合速率高于二倍體，大約是二倍體植株的1.21倍(圖4)，說明染色體加倍的毛竹植株在光合特性方面要優(yōu)于普通的二倍體植株。

圖4 不同倍性毛竹葉片的光合速率

2.4 不同倍性植株形態(tài)比較

與二倍體對(duì)照相比，四倍體植株表現(xiàn)為植株健壯、株高增高(圖5A、C)，葉片長(zhǎng)度和寬度都有所增加(圖5B、D、E)

圖5 毛竹二倍體與四倍體的形態(tài)特征

3 討論

Winkler(1916)在研究龍葵(Solanumnigrum)嫁接時(shí)從其愈傷組織得到了四倍體植物，首先引入了多倍體這一概念。Blakeslee等(1937)首次發(fā)現(xiàn)用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的方法，此方法已經(jīng)在經(jīng)濟(jì)作物、觀賞植物、藥用植物等方面得到了廣泛的運(yùn)用。目前對(duì)植物進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)是獲取新品種的最有效育種方法之一(Kunitakeetal.， 1998； 蔣淑磊等， 2015； 張宏宇等， 2019)。

研究表明，只有在一定濃度范圍以及合適的處理時(shí)間內(nèi)，秋水仙素才可以有效地誘導(dǎo)植物多倍體的發(fā)生。秋水仙素的毒性作用與使用的濃度和處理時(shí)間成正比，往往認(rèn)為秋水仙素濃度接近于半致死濃度時(shí)，誘導(dǎo)多倍體效率最高(羅靜等， 2005)。秋水仙素誘導(dǎo)濃度過低，其對(duì)植物材料的誘導(dǎo)效果就不明顯，并且產(chǎn)生混倍體的幾率也就越大。適宜的處理時(shí)間可以使足夠的藥量進(jìn)入誘導(dǎo)材料的細(xì)胞內(nèi)而且又不傷害細(xì)胞本身，處理時(shí)間過短則可能造成秋水仙素?zé)o法完全作用于植物材料，處理時(shí)間過長(zhǎng)則可能對(duì)植物材料產(chǎn)生較大的毒害作用，增加其死亡率。

本研究參考了相關(guān)文獻(xiàn)，也經(jīng)過大量的前期試驗(yàn)驗(yàn)證，濃度從7、6、5、4、3、2、1 g·L-1到0.1 g·L-1，時(shí)間從8、12、24、48 h到72 h，每個(gè)梯度都做過嘗試，最終發(fā)現(xiàn)在秋水仙素濃度超過5 g·L-1時(shí)對(duì)毛竹的致死率幾乎是百分之百，而低濃度短時(shí)間處理其效果不明顯。因此，在經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)后，最終確定了處理濃度(0.1、0.5、1、2 g·L-1)和時(shí)間(24、48、72 h)的組合，并且在后續(xù)的試驗(yàn)中也驗(yàn)證了這個(gè)組合是比較理想的，特別是在濃度0.5 g·L-1處理48 h以上和1 g·L-1處理12 h以上都誘導(dǎo)出了四倍體。在關(guān)于秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體中，誘導(dǎo)出的植株以三倍體和四倍體居多，如三倍體西瓜(豆峻嶺等， 2015)、四倍體桑(Morusalba)(Chakrabortietal., 1998)等，也有八倍體和十二倍體，如八倍體柳枝稷‘京稷31’(Panicumvirgatum)(吳海燕等， 2019)、十二倍體羅田甜柿(Diospyroskaki)(谷曉峰等， 2003)。雖然本研究?jī)H成功誘導(dǎo)出15株四倍體毛竹，但這無(wú)疑為毛竹育種增加了新的種質(zhì)資源。

植物多倍體的直接的鑒定方法通常分為染色體計(jì)數(shù)和細(xì)胞DNA含量測(cè)定等(王麗艷等， 2004； 費(fèi)希同等， 2014)。其中，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞中的DNA總量，這種方法不僅具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，還能夠檢驗(yàn)出混倍體(王麗艷等， 2004； 張虹等， 2017)。細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，如氣孔的密度及其保衛(wèi)細(xì)胞的大小(Abaketal., 1998; Becketal., 2003)、植株的高生長(zhǎng)和光合效率等(Liuetal., 2007; Tangetal., 2010)，也被用于倍性測(cè)定的間接指標(biāo)。由于毛竹染色體數(shù)量較多(陳瑞陽(yáng)等， 2003)，筆者在對(duì)多倍體毛竹進(jìn)行鑒定時(shí)，主要采用流式細(xì)胞儀測(cè)定法，并通過該方法鑒定了15株四倍體； 在這基礎(chǔ)上，通過比較二倍體和四倍體間氣孔密度及保衛(wèi)細(xì)胞的大小、植株的高生長(zhǎng)和葉片的光合效率等細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)毛竹四倍體確實(shí)發(fā)生了“巨大化”現(xiàn)象(韋榮昌等， 2013； 洪陳潔等， 2014)，這也間接地證實(shí)了獲得毛竹四倍體的可靠性。

4 結(jié)論

多倍體的誘導(dǎo)是重要而高效的植物育種技術(shù)，但迄今還沒有關(guān)于人工誘導(dǎo)毛竹同源多倍體的報(bào)道。本研究利用秋水仙素對(duì)毛竹種子進(jìn)行多倍體誘變處理，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法對(duì)處理后的植株進(jìn)行DNA相對(duì)含量測(cè)定，結(jié)果表明共獲得15株四倍體毛竹。秋水仙素濃度為0.5 g·L-1、處理時(shí)間為72 h，及秋水仙素濃度為1 g·L-1、處理時(shí)間為24 h時(shí)，誘導(dǎo)效果最佳。四倍體植株與二倍體植株相比，其株高增加，葉片變長(zhǎng)增寬，光合效率也明顯提升。綜上，利用秋水仙素誘導(dǎo)處理毛竹種子可為毛竹新品種的選育提供新的種質(zhì)資源。