徐雪嬌，范文棟，齊子棠，張 悅，謝 璐，何秀麗，李天英

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一，到2020年抑郁癥將成為世界第二大疾病[1-3]。它不僅給患者帶來極大的痛苦，還給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。其治療越來越受到人們的重視，傳統(tǒng)西藥治療副作用大，且易出現(xiàn)耐藥性。針刺治療抑郁癥具有療效好、副作用小的優(yōu)勢[4 -5],其治療機(jī)制尚不清楚。在眾多的抑郁動物模型中，慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)大鼠模型在抑郁癥的研究中頗為常見[6-7]。本實(shí)驗(yàn)選用百會穴，觀察針刺治療抑郁大鼠對糖水消耗的影響，并運(yùn)用GC-MS(gas chromotography/mass spectrometry)代謝組學(xué)平臺，探究針刺治療抑郁癥對中樞代謝水平的影響，挖掘相關(guān)代謝通路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購入18只雄性SD大鼠。喂養(yǎng)1周后開始適應(yīng)2%蔗糖水溶液。飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物食水，溫度21～23℃，濕度45%～55%，光照周期12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程

如圖1，大鼠適應(yīng)2%蔗糖水溶液5周后隨機(jī)分成CUMS大鼠(12只)和對照組大鼠(6只)，放在不同房間。CUMS大鼠開始進(jìn)行慢性不可預(yù)見性溫和刺激，對照組大鼠不予任何刺激。4周刺激結(jié)束后隨機(jī)平均分為CUMS組和CUMS+針刺組，隨后CUMS+針刺組開始針刺治療。糖水消耗實(shí)驗(yàn)(Sucrose preference test,SPT)每周固定時(shí)間進(jìn)行。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.3 CUMS流程

采用經(jīng)典的CUMS造模方法[8]。具體方法合籠(4～6 h)、空籠(8～12 h)、傾斜鼠籠45°(4～12 h)、濕籠(6～8 h)、夜間光照(12 h)和頻閃(12 h)等方法，每日給予1～2種刺激且相鄰兩天刺激方法不重復(fù)。

1.4 行為學(xué)

糖水消耗實(shí)驗(yàn)(SPT)測量24 h內(nèi)2%蔗糖水溶液消耗的百分比。糖水瓶和純水瓶的位置在第12 h交換。

1.5 針刺干預(yù)

參考已發(fā)表文獻(xiàn)[9]。華佗牌針具(0.18 mm×13 mm，蘇州醫(yī)藥有限公司制造)，上午9點(diǎn)，針刺百會穴(GV20，兩耳尖連線中點(diǎn)),消毒后進(jìn)針5 mm，留針20 min，連續(xù)針刺3周。

1.6 取材

7%水合氯醛麻醉大鼠后斷頭取腦，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 GC-MS檢測與分析

GC-MS檢測和分析方法基于本研究組已發(fā)表的文章[10-11]。

1.7.1 樣品制備 取30 mg樣本加入到1.5 mL離心管中，加入20 μL甲醇配置的0.3 mg/mL內(nèi)標(biāo)(L-2-氯-苯丙氨酸)。于-80℃冰箱中放置2 min后研磨(60 Hz，2 min)，超聲提取10 min。-20℃靜置30 min后低溫離心15 min(13 000 rpm，4℃)，取400 μL的上清液，裝入玻璃衍生瓶中。

1.7.2 色譜條件 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀選用Agilent公司的7890A-5975C(Agilent,USA)。衍生化之后采用不分流的方式注入樣品，進(jìn)樣量1 μL。經(jīng)毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Folsom,CA,USA)(HP-5MS)分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。高純度氦氣作為載氣(6.0 mL/min)。升溫程序：60℃→125℃→190℃→210℃→310℃。

1.7.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度：230℃。四極桿溫度：150℃。電子能量：70 eV。全掃描模式(SCAN)范圍：50～600 m/z。

1.8 數(shù)據(jù)分析

1.8.1 行為學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0，采用Studentt檢驗(yàn)、非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析 ChromaTOF(v 4.34,LECO,St Joseph,MI)軟件預(yù)處理原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)出的數(shù)據(jù)矩陣可獲得樣品的基本信息、代謝物名稱、質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度和內(nèi)標(biāo)峰。其中假陽性峰已經(jīng)除去并去除冗余與峰合并。歸一化質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度后得到數(shù)據(jù)矩陣，將其導(dǎo)入SIMCA-P+14.0、Umetrics、Umea、Sweden軟件包。無監(jiān)督的主成分分析(PCA)用于評估總體分布和穩(wěn)定性，有監(jiān)督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA用來找到組間差異代謝物。循環(huán)交互驗(yàn)證(7次)和排序檢驗(yàn)(200次)用于評價(jià)模型是否存在過度擬合。

2 結(jié)果

2.1 針刺百會穴對CUMS大鼠SPT的影響

4周慢性不可預(yù)見性溫和刺激后，CUMS大鼠糖水消耗顯著低于對照組大鼠(P<0.01)。針刺治療結(jié)束后，針刺大鼠與對照組大鼠糖水消耗差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：與對照組比較,**P<0.01。圖2 糖水消耗

2.2 針刺百會穴對CUMS大鼠腦代謝組學(xué)影響

圖3為對照組、CUMS組、CUMS+針刺組總離子流圖。如圖4所示，PCA分析得出3組之間能夠區(qū)分。OPLS-DA分析能夠?qū)?組明顯區(qū)分，表明3組間存在顯著的代謝差異。R2X、R2Y和Q2均是大于零，說明OPLS-DA模型是可靠的。在排列檢驗(yàn)中，R2與Q2值明顯大于置換的R2與Q2，證明不存在過擬合。OPLS-DA載荷圖鑒定出81種差異代謝物。分析結(jié)果表明針刺百會穴治療CUMS大鼠3周后，腦組織中L-同型半胱氨酸和甲氧芐氨嘧啶發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。見表1。

圖3 3組總離子流圖

圖4 代謝組學(xué)分析

表1 3組腦差異代謝物(對照組與CUMS組具有差異的代謝物)

2.3 代謝通路分析

使用KEGG和HMDB尋找2種逆轉(zhuǎn)的腦差異代謝物的潛在代謝途徑。MetaboAnalyst 3.0用來確定潛在途徑的影響值。結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)的差異代謝物主要參與以下兩個(gè)代謝途徑：①半胱氨酸、蛋氨酸代謝;②嘧啶代謝。見圖5。代謝途徑如圖6所示。

圖5 使用MetaboAnalyst 3.0進(jìn)行逆轉(zhuǎn)代謝物的代謝途徑分析

圖6 針刺治療CUMS大鼠逆轉(zhuǎn)代謝物(劃線)參與的代謝途徑

3 討論

尋找有效的治療方法是抑郁癥亟待解決的問題。針刺作為傳統(tǒng)治療手段，在抑郁癥的治療中突顯優(yōu)勢，其治療效果顯著，除疼痛外無明顯副作用[12-14]。有望取代傳統(tǒng)抗抑郁藥物而成為抑郁癥治療的主要手段。百會穴為督脈上的重要穴位，臨床應(yīng)用十分廣泛，在抑郁癥的治療上起到了十分有效的作用[15-16]。糖水消耗作為評價(jià)抑郁癥行為學(xué)中的金標(biāo)準(zhǔn)，其在抑郁癥的研究中是不可缺少的[17-18]。在抑郁癥的臨床研究中，腦組織的取材十分困難，本研究采用經(jīng)典的抑郁癥動物模型——慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激大鼠，觀察針刺百會穴治療抑郁癥對糖水消耗和腦代謝水平的影響。從行為學(xué)到中樞代謝探究針刺治療抑郁癥的理論依據(jù)。

經(jīng)過4周的刺激，CUMS大鼠的糖水消耗值顯著下降，說明模型成功。3周的針刺治療后，CUMS+針刺大鼠的糖水消耗值恢復(fù)到正常水平，說明針刺對抑郁樣行為具有逆轉(zhuǎn)作用。本研究基于GC-MS代謝組學(xué)平臺，對CUMS組、CUMS+針刺組和對照組大鼠的腦組織進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示經(jīng)過3周針刺治療，CUMS大鼠腦中L-同型半胱氨酸和甲氧芐氨嘧啶水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)。氨基酸和嘧啶的代謝紊亂在神經(jīng)精神疾病中較為常見。同型半胱氨酸是一種在蛋氨酸代謝過程中產(chǎn)生的十分重要的氨基酸。若同型半胱氨酸不轉(zhuǎn)化為蛋氨酸或半胱氨酸則可以引起神經(jīng)毒性[19]。Chung等研究表明臺灣地區(qū)青少年中抑郁焦慮發(fā)病率增高與其血清中半胱氨酸代謝紊亂有關(guān)[20]。有研究表明，抑郁癥伴自殺意念合并運(yùn)動障礙的患者，其同型半胱氨酸的調(diào)節(jié)大都出現(xiàn)異常[21]。在抑郁癥嘧啶代謝紊亂的相關(guān)研究中，本課題組的前期研究結(jié)果顯示，雙相情感障礙患者(抑郁相)尿液中尿嘧啶的代謝紊亂[10]。代謝通路分析結(jié)果顯示L-同型半胱氨酸和甲氧芐氨嘧啶主要參與半胱氨酸、蛋氨酸代謝和嘧啶代謝。以上結(jié)果提示，針刺治療抑郁癥可能是通過調(diào)節(jié)以上代謝通路完成的。

綜上所述，針刺能夠逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為并調(diào)節(jié)腦代謝，為針刺治療抑郁癥提供中樞水平的理論依據(jù)。下一步，筆者將在針刺治療過程中采集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)，研究針刺治療抑郁癥過程中對代謝的調(diào)節(jié),為針刺治療抑郁癥代謝水平提供更加全面的數(shù)據(jù),為針刺成為抑郁癥的主要治療手段提供理論依據(jù)。