房毓敏，楊娜娜，楊 光，趙 俊，羅 彤，王榮國(guó)，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

骨骼肌損傷在肌肉損傷中所占比例最高[1]。研究表明[2]受損后的骨骼肌往往不能完全修復(fù)，這會(huì)導(dǎo)致骨骼肌正常功能受到影響，而影響骨骼肌不完全修復(fù)的關(guān)鍵因素就是損傷后造成的去神經(jīng)支配[3]。神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)與骨骼肌的橋梁，是完成神經(jīng)與肌肉信號(hào)傳導(dǎo)從而控制肌肉運(yùn)動(dòng)使肌肉重獲神經(jīng)支配的重要結(jié)構(gòu)和功能單位[4]，因此越來越多學(xué)者認(rèn)為研究骨骼肌損傷后NMJ的重建過程是研究受損骨骼肌再生和功能重建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一直以來，乙酰膽堿受體(AChR)的簇集都被公認(rèn)為是形成和維持NMJ的標(biāo)志[5]。肌特異性受體酪氨酸激酶(MuSK)作為一種跨膜AChR藕聯(lián)酪氨酸激酶，是調(diào)控AChR簇集眾多信號(hào)通路中的關(guān)鍵性物質(zhì)[6]，在AChR簇集過程中起著非常重要的作用[7]，研究表明MuSK蛋白的表達(dá)對(duì)于NMJ組織結(jié)構(gòu)和功能的完整都是必須的[8]。淀粉樣前體蛋白(APP)存在于大腦的突觸結(jié)構(gòu)和骨骼肌的NMJ中，是NMJ正常形成和功能所必需的[9]，其可以通過不依賴于集聚蛋白的方式來誘導(dǎo)MuSK磷酸化[10]，從而促進(jìn)AChR的聚集。前期研究表明,電針可以促進(jìn)骨骼肌損傷后神經(jīng)肌肉接頭的重建[11]，但相關(guān)機(jī)制的研究還不明確，所以本研究選取MuSK和APP這兩個(gè)具有代表性的蛋白來初步探討電針促進(jìn)骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭重建的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量240～260 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(京)2016-0006。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)入后于室溫23℃、空氣流通相對(duì)濕度60%、12 h晝夜循環(huán)光照的環(huán)境下適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)1周，在此期間自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置遵循中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[12]。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后將54只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(A組)、模型組(B組)和電針組(C組)，每組18只。

1.1.2 主要儀器和試劑 韓式穴位神經(jīng)刺激儀(HANS200E，南京濟(jì)生);急性骨骼肌鈍器傷砸傷器(北京中醫(yī)藥大學(xué)中日友好醫(yī)院);一次性無菌針灸針(華佗牌，0.25 mm×25 mm);DYY-6C 型電泳儀(BIO-RAD Mini-TRANS-BLOT CELL);DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽;TS-1 脫色搖床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);生物分子成像儀(日本富士LAS-4000MINI);MuSK(abcam，ab228488)；Amyloid Precursor protein(abcam，ab32136)。

1.2 動(dòng)物模型建立及干預(yù)方法

1.2.1 動(dòng)物造模 A組為正常對(duì)照組不予處理。B組和C組用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，動(dòng)物俯臥位右后肢外展，膝關(guān)節(jié)伸直，踝關(guān)節(jié)背伸呈90°位固定。用造模工具一次性打擊大鼠右后肢腓腸肌中段內(nèi)側(cè)面，打擊面積1 cm2，動(dòng)能2.45 J，為保證每只動(dòng)物腓腸肌受損程度及部位一致，所有動(dòng)物的造模均由一人操作完成。造模成功后局部皮膚未破損，脛腓骨無骨折，肉眼觀察腓腸肌中斷有明顯腫脹及瘀血。

1.2.2 干預(yù)方法 C組大鼠于造模后24 h用自制布袋固定，雙后肢伸直，取左側(cè)“足三里(ST36)”穴(參照《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》)，右側(cè)阿是穴(分別取在距損傷邊緣頭尾側(cè)10 mm處)作為針刺穴位，常規(guī)消毒，使用規(guī)格為0.25 mm×25 mm一次性無菌針灸針刺入5～8 mm，針刺后接HANS 200E穴位神經(jīng)刺激儀。電針參數(shù)：0.4 mA，2 Hz，15 min/次[13]，隔天1次，直到取材。A組和B組同步進(jìn)行模擬固定，但不進(jìn)行電針刺激。

1.3 取材及標(biāo)本處理

各組分別于造模后第7、28、56天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取材6只動(dòng)物。沿打擊部位用鋒利的一次性刀片快速切取腓腸肌，用 PBS 緩沖液沖洗干凈后，一部分放入事前準(zhǔn)備好的凍存管中，于液氮凍存0.5 h，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱。另一部分用4%多聚甲醛固定，備以石蠟切片及HE染色。

1.4 HE染色觀察

將取完材標(biāo)本組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，用石蠟將組織包埋后，使用石蠟切片機(jī)切片(4 μm)，室溫，切片盒保存；使用二甲苯及各濃度乙醇進(jìn)行脫蠟，蘇木素染色，分化，伊紅染色，脫水，透明，封片。于生物顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，經(jīng)圖像采集系統(tǒng)收集圖片。

1.5 MuSK和APP蛋白表達(dá)水平測(cè)定

組織加入裂解液提取MuSK和APP蛋白，分裝，置-80℃冰箱待用。稱取等量蛋白樣品經(jīng)SDS聚丙烯凝膠電泳分離后，并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)上，于封閉液中室溫振搖封閉2 h，再加入一抗進(jìn)行雜交，于4℃反應(yīng)過夜。TBST洗4次，加入二抗，室溫振搖反應(yīng)1 h，洗3次，每次5 min，用ECL試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，X線膠片曝光，顯影及定影。上述孵育和洗膜過程均在水平搖床上進(jìn)行，膠片曝光在暗室內(nèi)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組組織形態(tài)學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，損傷后7 d，正常對(duì)照組大鼠肌組織染色呈粉色，肌纖維排列整齊，其間有少量結(jié)締組織，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整；模型組大鼠肌組織染色改變，肌纖維斷裂、降解、排列紊亂，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少量新生肌細(xì)胞形成；電針組較模型組相比炎性細(xì)胞較少，有大量新生肌細(xì)胞和少量結(jié)締組織形成，且排列趨于規(guī)則。損傷后28 d，模型組大鼠新生肌胞增多，肌纖維排列較為紊亂，結(jié)締組織增多，炎性細(xì)胞減少；電針組大鼠肌組織染色改變基本恢復(fù)正常，肌管融合肌纖維排列較為整齊，結(jié)締組織增多。損傷后56 d，模型組大鼠肌纖維進(jìn)一步增多，排列逐漸整齊，結(jié)締組織增多，炎性細(xì)胞大量減少；電針組大鼠肌纖維排列整齊，損傷基本愈合，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整。見圖1。

注：A.對(duì)照組；B.7 d模型組；C.7 d電針組；D.28 d模型組；E.28 d電針組；F.56 d模型組；G.56 d電針組。圖1 各組腓腸肌組織形態(tài)觀察(HE染色，20×)

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MuSK蛋白表達(dá)

Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MuSK在正常大鼠骨骼肌中蛋白表達(dá)水平較低，損傷后7 d各組表達(dá)水平明顯升高，28 d達(dá)到高峰，56 d時(shí)表達(dá)下降。整個(gè)過程中各取材時(shí)間點(diǎn)，模型組始終高于正常對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，且電針組高于模型組(P<0.05或P<0.01)。見表1、圖2。

表1 各取材時(shí)間點(diǎn)MuSK蛋白表達(dá)的變化

注：A.7 d對(duì)照組；B.7 d模型組；C.7 d電針組；D.28 d對(duì)照組；E.28 d模型組；F.28 d電針組；G.56 d對(duì)照組；H.56 d模型組；I.56 d電針組。圖2 各取材時(shí)間點(diǎn)MuSK蛋白表達(dá)量

2.3 各組不同時(shí)間點(diǎn)APP蛋白表達(dá)

APP在正常大鼠骨骼肌中的蛋白表達(dá)量較少，在隨后的損傷恢復(fù)過程中表達(dá)逐漸增多。與正常對(duì)照組相比，模型組在損傷后7 d時(shí)APP蛋白的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，隨后逐漸增多，在28 d時(shí)增多最為明顯(P<0.05)，在56 d時(shí)表達(dá)趨于穩(wěn)定(P<0.05)；與模型組相比，在7 d時(shí)電針組表達(dá)明顯增多(P<0.01)，在28 d時(shí)達(dá)到峰值(P<0.05)，在56 d時(shí)表達(dá)有所回落但仍高于模型組(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 各取材時(shí)間點(diǎn)APP蛋白表達(dá)量的變化

注：A.7 d對(duì)照組；B.7 d模型組；C.7 d電針組；D.28 d對(duì)照組；E.28 d模型組；F.28 d電針組；G.56 d對(duì)照組；H.56 d模型組；I.56 d電針組。圖3 各取材時(shí)間點(diǎn)APP蛋白表達(dá)量

3 討論

骨骼肌損傷屬于中醫(yī)“筋傷”的范疇。早在《靈樞·邪氣臟腑病形篇》中指出：“有所墮墜，惡血留內(nèi)”；《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》云:“跌打損傷之癥,專從血論……皮不破而內(nèi)損傷者,多有瘀血”；并且《雜病源流犀燭·跌撲閃挫源流》記載：“忽然閃挫，必氣為之震，震則激，激則壅，壅則氣之周流一身者，忽因所壅而聚在一處 ……氣凝在何處，則血亦凝在何處”,指出人體損傷后多形成瘀血，而己經(jīng)生成的瘀血會(huì)阻滯正常氣血運(yùn)行,造成局部氣血塞滯,從而使得皮肉筋骨經(jīng)脈失于濡養(yǎng)，日久損傷局部會(huì)纖維化形成瘢痕組織，阻礙肌纖維和神經(jīng)纖維的重新連接，導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳輸障礙，從而延遲或阻礙NMJ重塑、減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量，導(dǎo)致骨骼肌功能下降。近年來，各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)驗(yàn)研究均表明電針在治療骨骼肌損傷方面有著值得肯定的療效，Wang等[14]研究證實(shí)電針足三里和阿是穴具有行氣活血的作用，能通過有效控制過度纖維化和改善微循環(huán)促進(jìn)骨骼肌再生。張安寧等[15]研究發(fā)現(xiàn)電針足三里、阿是穴聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練可以增加損傷骨骼肌mTOR表達(dá)量，正向調(diào)控myoG、Fast MyHC的表達(dá)，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化成熟，縮短骨骼肌損傷的治療療程。袁海洲[16]發(fā)現(xiàn)電針的刺激能促進(jìn)受損更多的骨骼肌合成Agrin，進(jìn)而加強(qiáng)AChR的募集促使受損骨骼肌功能的恢復(fù)。劉守堯[17]通過建立家兔腓腸肌急性鈍器挫傷模型,發(fā)現(xiàn)電針阿是穴與足三里能夠有效恢復(fù)損傷后電生理屬性。董明非[18]用電針治療肌肉拉傷患者30例，其中第1周治愈18例，占60%，第2周治愈12例，占40%，總治愈率達(dá)100%。黃瑩儀[19]以常規(guī)方法(冷敷和繃帶包扎)和電針法治療肌肉拉傷患者共48例(每組各24例)，其中常規(guī)治療有效率為79.17%，電針治療有效率為95.83%，明顯高于常規(guī)治療組(P<0.05)。陳斌等[20]采用電針治療肌肉拉傷足球運(yùn)動(dòng)員46例，痊愈率達(dá)到100%。

受損骨骼肌恢復(fù)過程中NMJ的再生與重建是肌肉重獲神經(jīng)支配的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而NMJ在發(fā)育和成熟過程中最具代表性的特征就是突觸后膜AChR的簇集，AChR的簇集情況體現(xiàn)了NMJ的發(fā)育和成熟情況[21]。MuSK作為骨骼肌特異性酪氨酸激酶受體，選擇性的由發(fā)育中的骨骼肌細(xì)胞表達(dá)并聚集在突觸后膜上，能夠在 NMJ 處與突觸后膜AChR聚集簇共定位[22]，其蛋白水平可以在一定程度上反映NMJ發(fā)育調(diào)控的程度。MuSK與常規(guī)的酪氨酸激酶受體結(jié)構(gòu)相同，含有1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)跨膜域、1個(gè)胞漿域和1個(gè)大的胞外域，這一胞外域結(jié)構(gòu)可以與神經(jīng)源性聚集蛋白Agrin反應(yīng)，使MuSK被快速磷酸化，從而介導(dǎo)AChR的聚集[23]， 但在這一過程中兩者并不是直接相互作用，而是通過一個(gè)MASC的共受體來介導(dǎo)[24]，這個(gè)共受體就是低密度脂蛋白受體超家族成員 LRP4，研究表明LRP4胞外段的第一個(gè)β-螺旋槳卷曲結(jié)構(gòu)能特異性結(jié)合z+Agrin蛋白C端的LG3結(jié)構(gòu)域[25]，從而以四聚體的形式激活MuSK，進(jìn)而激活相應(yīng)信號(hào)通路，導(dǎo)致突出分化，包括AChR的聚集[26]。目前Agrin/MuSK信號(hào)通路是AChR簇集過程中非常重要的1條信號(hào)通路，其中Agrin和MuSK共同發(fā)揮著主要作用，但Kim等[26-27]研究發(fā)現(xiàn)在AChR簇集過程中MuSK似乎發(fā)揮著更為重要的作用：MuSK基因敲除的小鼠在整個(gè)發(fā)育過程中根本不出現(xiàn)突觸后膜分化的特征，幾乎完全沒有AChR的聚集；而Agrin缺失的小鼠體內(nèi)在突觸和非突觸部位仍能看到AChR的聚集過程?？梢奙uSK的表達(dá)對(duì)NMJ重建過程中AChR的簇集是必需的，MuSK蛋白表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致NMJ整體結(jié)構(gòu)和功能的不完整[28]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠骨骼肌中MuSK表達(dá)水平較低，在損傷后7 d表達(dá)顯著升高，28 d時(shí)達(dá)到高峰，隨后有所回落。提示在骨骼肌損傷后的修復(fù)過程中AChR在28 d時(shí)完成聚集，且在各取材時(shí)間點(diǎn)電針組的MuSK表達(dá)始終高于模型組，說明電針可以促進(jìn)MuSK的表達(dá)，從而強(qiáng)化AChR的募集使相同時(shí)間內(nèi)較模型組相比電針組受損骨骼肌得到了更大程度的恢復(fù)。

淀粉樣前體蛋白(APP)是一種單次跨膜蛋白質(zhì)，正常情況下，APP 可參與一系列生理功能，如軸突生長(zhǎng)、信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子平衡以及細(xì)胞黏附等。在骨骼肌中，APP蛋白存在于肌纖維中，隨著發(fā)育的進(jìn)行逐漸集中在NMJ上[29]，是NMJ正常形成和功能所必需的[30]。同時(shí)APP也是一種發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)在神經(jīng)元分化期間增加，并且在突觸連接完成時(shí)最高[31]。研究表明APP基因缺乏小鼠會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)缺陷[32]，小鼠體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量也會(huì)減少[33]。Choi HY 等[10]研究表明APP參與和調(diào)控NMJ的形成：首先APP可以通過與Agrin和LRP4相互作用的形式來進(jìn)一步將AChR聚集所需的所有組分募集到最大密度區(qū)域，從而確保AChR聚集在體內(nèi)限制到神經(jīng)接觸部位；其次在Agrin缺失的情況下，APP可以與LRP4相互作用部分激活MuSK信號(hào)通路促進(jìn)AChR的聚集，同時(shí)APP也可以直接與Agrin結(jié)合，盡管親和力低于LRP4；最后APP及其異構(gòu)體相互結(jié)合后可以產(chǎn)生或加強(qiáng)神經(jīng)末梢的附著位點(diǎn)，從而增加了AChR聚集的可能性。 由此可見APP的表達(dá)在NMJ發(fā)育成熟過程中是必不可少的。在本實(shí)驗(yàn)中電針組APP的表達(dá)在損傷后第7天明顯增加，第28天達(dá)到高峰，56 d時(shí)有所回落，說明電針組在損傷后7 d內(nèi)神經(jīng)元開始分化，在第28天時(shí)突觸連接完成，隨后APP蛋白表達(dá)逐漸減少，這一過程與MuSK蛋白在損傷過程中的表達(dá)情況相一致；模型組在損傷后7 d、28 d APP表達(dá)顯著升高，而在損傷后28～56 d APP蛋白水平基本沒有變化，提示損傷后大鼠在28 d后模型組自然恢復(fù)速度非常緩慢，而電針的刺激可以縮短這一恢復(fù)過程，加速受損骨骼肌的修復(fù)，促進(jìn)骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭更快的恢復(fù)重建。

由此可見，電針作為中國(guó)傳統(tǒng)技術(shù)和現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的結(jié)合，其可以通過脈沖結(jié)合針體刺激肌肉的方式來緩解局部的炎癥反應(yīng)，加快受損骨骼肌神經(jīng)與肌肉的連接，同時(shí)正向調(diào)控骨骼肌MuSK和APP蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)NMJ的重建從而促進(jìn)骨骼肌功能的恢復(fù)，且這種治療方法不僅療效可觀而且簡(jiǎn)便易行，無毒副作用，更加豐富了骨骼肌損傷的臨床治療方法。但其促進(jìn)NMJ重建的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。