洪 剛,王 丹

(重慶開州區(qū)人民醫(yī)院,重慶 405400)

近年來，腰椎間盤突出癥發(fā)病率受年齡及職業(yè)因素的影響而日漸升高，其病程長，主要表現(xiàn)為局部腰痛及下肢放射性疼痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。神經(jīng)機(jī)械壓迫、炎癥刺激、血供障礙等是腰椎間盤突出癥主要發(fā)病機(jī)制，針刀療法對腰椎間盤突出癥患者療效確切，可利用鋒利刀刃對軟組織損傷處條索、硬結(jié)、粘連等進(jìn)行切割、剝離，恢復(fù)關(guān)節(jié)處力學(xué)平衡，同時結(jié)合了毫針針刺疏通損傷組織氣血，達(dá)到治療效果[2],而獨(dú)活寄生湯具有鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液循環(huán)等功效，也已逐步應(yīng)用于腰椎間盤突出癥的治療中[3]，但有關(guān)兩者聯(lián)合應(yīng)用的報道尚不多見，因此本研究旨在探究針刀療法與獨(dú)活寄生湯聯(lián)合應(yīng)用治療腰椎間盤突出癥大鼠的效果，分析其對背根神經(jīng)節(jié)炎癥的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

70只清潔級健康SD大鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：2001A046，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，室溫25℃左右，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.2 主要試劑

獨(dú)活寄生湯(購于中國人民解放軍第202醫(yī)院藥局，藥方組成：獨(dú)活12 g，秦艽、杜仲、桑寄生、牛膝、細(xì)辛各9 g，防風(fēng)、干地黃、當(dāng)歸、茯苓、川芎、肉桂心、芍藥、人參各6 g，甘草3 g)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(金斯瑞生物科技有限公司)；碘伏消毒劑(北京百諾威生物科技有限公司)等。

1.3 主要儀器

9號腰椎穿刺針(上海埃斯醫(yī)械塑料制品有限公司)；一次性無菌HZ系列漢章針刀(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司，0.4 mm×0.4 mm)；PL-200型熱痛測試儀(四川科儀誠科技有限公司)；5810R型低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；JY-SCZ2180型垂直電泳槽(西安賽維斯生物科技有限公司)；NOVA型超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)；CX23型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Q550圖像處理系統(tǒng)(德國LEICA公司)。

1.4 動物模型構(gòu)建及分組

將70只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、獨(dú)活寄生湯組、針刀組、針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組，各14只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均構(gòu)建腰椎間盤突出癥大鼠模型[4]：術(shù)前1 d，于大鼠背部脫毛，以3.5 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，距鼠尾根部1 cm處切斷鼠尾，切開尾部椎間盤見髓核呈膠凍樣(約10 mg)，取5個髓核，1 mg髓核加1 μL生理鹽水，混勻制備自體髓核混懸液,大鼠取屈曲側(cè)臥位，以9號腰椎穿刺針于L4～5棘突間隙行硬膜外穿刺，注射20 μL自體髓核混懸液，于硬膜外腔注射30 μL 2%利多卡因；假手術(shù)組以20 μL生理鹽水替代大鼠自體髓核混懸液，其他操作均同上。待大鼠清醒后若雙前肢活動自如，雙后肢運(yùn)動、感覺喪失或減退，30 min左右完全恢復(fù)即證明硬膜外穿刺成功，繼續(xù)觀察，若大鼠雙后肢無癱瘓，且兩側(cè)后足熱痛反應(yīng)出現(xiàn)痛覺過敏即證明模型制備成功。

1.5 各組動物干預(yù)方法

1.5.1 獨(dú)活寄生湯組 建模3 d后開始灌胃獨(dú)活寄生湯13.8 mg/kg，1次/d，連續(xù)灌胃2周；

1.5.2 針刀組 建模3 d后進(jìn)行針刀療法：將大鼠以自制襪套固定于鼠板上，于L4～5棘間、L4～5棘間旁開0.1 cm處、患椎上下橫突及雙側(cè)坐骨神經(jīng)出口處以碘伏消毒，進(jìn)行針刀操作，均以HZ系列一次性針刀進(jìn)行針刀操作，①棘間：針刀刀口線方向與脊柱縱向軸方向一致，按四部規(guī)程刺入，待針刀有落空感(突破黃韌帶時)微提針刀，稍加推進(jìn)；②橫突點(diǎn)：針刀刀口線方向與脊柱縱向軸方向一致，按四部規(guī)程刺入，松解完橫突后將針刀退至淺層，傾斜針刀從外到內(nèi)，由淺層向深層松解至橫突根部，待有落空感時將針刀刀口線微調(diào)為“八字形”，向里稍加推進(jìn)；③坐骨神經(jīng)出口處：針刀刀口方向與坐骨神經(jīng)走向一致，按四部規(guī)程刺入，待針刀有落空感時微提針刀然后稍加推進(jìn)，均以碘伏消毒，進(jìn)行針刀操作，以大鼠下肢觸電樣抽動為度，3次/周，治療2周。

1.5.3 針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組 建模3 d后同時給予獨(dú)活寄生湯灌胃并施以針刀療法，方法同獨(dú)活寄生湯組及針刀組。

1.5.4 模型組及假手術(shù)組 建模后正常飼養(yǎng)。

1.6 大鼠熱痛刺激縮爪閾值

分別于干預(yù)前及干預(yù)2周后將各組大鼠置于PL-200型熱痛測試儀的檢測盒內(nèi)，加工熱光源通過儀器輻射到檢測盒底部玻璃板上并使其聚集至大鼠一側(cè)足底后半部分，光斑直徑5 mm，記錄從開始照射至縮爪時間間隔，左右足交替測試3次，2次測試間隔5 min，取平均值[5]。

1.7 HE染色

觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織病理變化,干預(yù)2周后待檢測大鼠熱痛刺激縮抓閾值結(jié)束后，將大鼠固定于鍘刀，端頭處死，迅速倒置，腹腔解剖，暴露并采集長約2 mm的L5神經(jīng)根組織，于10%甲醛中固定24 h，常規(guī)制備厚約4 μm石蠟組織切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理形態(tài)[6]。

1.8 ELISA法檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性因子含量

背根神經(jīng)節(jié)組織采樣同1.7，研磨、勻漿，并以生理鹽水按1:10比例進(jìn)行稀釋制備組織懸液，以ELISA法檢測背根神經(jīng)節(jié)組織中白細(xì)胞介素1(IL-1)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量[7]。

1.9 WB法檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性因子含量

背根神經(jīng)節(jié)組織采樣同1.7，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA法定量，取50 μg進(jìn)行WB檢測，以β-actin為內(nèi)參，經(jīng)Q550圖像分析軟件統(tǒng)計IL-1、TNF-α蛋白表達(dá)[8]。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠熱痛刺激縮爪閾值比較

模型組干預(yù)前及干預(yù)2周后熱痛刺激縮爪閾值均較假手術(shù)組縮短(P<0.05)；與模型組及干預(yù)前比較，干預(yù)2周后獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠熱痛刺激縮爪閾值均延長，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組長于獨(dú)活寄生湯組、針刀組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠熱痛刺激縮爪閾值比較

2.2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理學(xué)形態(tài)觀察

HE染色顯示，假手術(shù)組小鼠背根神經(jīng)節(jié)組織細(xì)胞排列整齊，胞核位于中央，大且圓，核仁清晰，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒樣尼氏小體；模型組細(xì)胞間隙距離增加，胞核固縮或偏移，胞質(zhì)溶解，呈空泡樣變，尼氏小體減少；獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組上述病理變化均有不同程度的減輕。見圖1。

注：A.假手術(shù)組; B.模型組; C.獨(dú)活寄生湯組; D.針刀組; E.針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組。圖1 HE染色觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理損傷(200×)

2.3 ELISA法檢測各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)炎性因子含量

ELISA檢測顯示，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1、TNF-α含量較假手術(shù)組顯著升高，而獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組較模型組顯著降低，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組顯著低于獨(dú)活寄生湯組及針刀組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1及TNF-α含量比較

2.4 WB法檢測各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)炎性因子含量

WB檢測顯示，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1、TNF-α蛋白相對表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高，而獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組較模型組顯著降低，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組顯著低于獨(dú)活寄生湯組及針刀組(P<0.05)。見圖2、表3。

注:A.假手術(shù)組; B.模型組; C.獨(dú)活寄生湯組; D.針刀組; E.針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組。圖2 WB法檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1及TNF-α蛋白含量(200×)

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1及TNF-α蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

腰椎間盤突出癥主要是由纖維環(huán)、髓核產(chǎn)生退行性變，纖維環(huán)破裂，髓核脫出，導(dǎo)致相鄰脊神經(jīng)根受刺激或壓迫所致[9-10]。其屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，風(fēng)、寒、濕、虛是其致病因素，而機(jī)體內(nèi)在的正虛是其發(fā)病的關(guān)鍵。獨(dú)活寄生湯最早記載于《備急千金要方》，主治風(fēng)寒濕痹，全方共奏祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎及補(bǔ)氣血之功，邪正兼顧，驅(qū)邪不傷正，扶正不留邪[10-11]。獨(dú)活寄生湯可有效調(diào)控腰椎間盤突出癥大鼠髓核組織及纖維環(huán)組織中MMP-1表達(dá)，抑制腰椎間盤退變，效果顯著；針刀療法整合了針刺療法及手術(shù)松解法，其利用“針刺”原理，疏通經(jīng)脈、行氣活血，并結(jié)合西醫(yī)“刀”的原理，松解粘連組織，解除擠壓，實(shí)現(xiàn)“以松致通、通則不痛”，可通過調(diào)節(jié)腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織致痛因子表達(dá)，改善其局部微循環(huán)，進(jìn)而達(dá)到治療目的[12-14]。目前有關(guān)針刀療法結(jié)合獨(dú)活寄生湯共同治療腰椎間盤突出的效果尚未見報道，因此本研究以腰椎間盤突出大鼠模型為研究對象，進(jìn)行初步探究。

腰椎間盤組織是機(jī)體最大的無血供組織，髓核因包裹于纖維環(huán)內(nèi)而與血液循環(huán)隔離，當(dāng)退行性病變或外傷導(dǎo)致椎間盤抗原與血液循環(huán)接觸后，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，釋放炎性介質(zhì)，誘發(fā)炎性病變，導(dǎo)致疼痛。針刀具有比普通毫針更強(qiáng)的針刺效應(yīng)及針感，刺激穴位及經(jīng)絡(luò)后可行氣活血、通經(jīng)止痛；同時還可刮除瘢痕，松解組織粘連，有利于吸收炎性介質(zhì)，消散炎性滲出，消除肌肉痙攣，恢復(fù)病變部位平衡，通利關(guān)節(jié)并改善關(guān)節(jié)功能。針刀療法能夠通過松解局部粘連改善腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛大鼠微循環(huán)、促進(jìn)炎癥因子代謝、緩解疼痛；而獨(dú)活寄生湯可抑制炎性因子生成， 減輕髓核所致炎性反應(yīng)，治療肝腎虧虛型腰椎間盤突出[15-16]。髓核脫出后可引發(fā)神經(jīng)根與背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)、功能變化，脊神經(jīng)根微循環(huán)與營養(yǎng)障礙是腰椎間盤突出癥的主要致痛機(jī)制[17]。本研究結(jié)果顯示，獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理損傷均較模型組有所改善。提示針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯可有效改善腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理損傷；此外本研究結(jié)果顯示，干預(yù)2周后獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠熱痛刺激縮爪閾值均較模型組延長，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組長于獨(dú)活寄生湯組及針刀組；此外，獨(dú)活寄生湯組、針刀組及針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織IL-1、TNF-α含量及其蛋白相對表達(dá)量較模型組顯著降低，且針刀聯(lián)合獨(dú)活寄生湯組顯著低于獨(dú)活寄生湯組及針刀組。提示針刀療法配合獨(dú)活寄生湯可有效降低腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性細(xì)胞因子含量，有效緩解其炎性損傷，緩解疼痛。

綜上，針刀療法配合獨(dú)活寄生湯可有效降低腰椎間盤突出癥大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織炎性因子含量，改善其組織病變，進(jìn)而明顯提高大鼠熱痛刺激縮爪閾值，減輕疼痛，具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，治療效果顯著，但有關(guān)其具體分子作用機(jī)制及獨(dú)活寄生湯的最佳應(yīng)用劑量尚需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。