張德寶 宋龍飛 梁忠祥 劉 佳

（1河北韓美生物科技有限公司，河北保定 071000；2河北正合生物制藥有限公司，河北石家莊 050000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，包括豬圓環(huán)病毒I型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），一般認(rèn)為PCV2具有致病性。與其他幾種豬的傳染病有關(guān)，包括PMWS（斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征）、PDNS（皮炎腎病綜合征）、PRDC（豬呼吸道病綜合征）等，我國(guó)最早在2000年證實(shí)有該病毒的存在。此后，由該病引起或誘發(fā)的豬相關(guān)性疾病，對(duì)國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)均造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)該病暫無(wú)有效的治療措施，疫苗預(yù)防仍是該病最有效的防治手段。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)出多種針對(duì)PCV2的疫苗，其中以亞單位疫苗、全病毒滅活疫苗為主，在其中佐劑發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，疫苗中添加合適的抗原穩(wěn)定劑，有助于提高抗原本身的穩(wěn)定性，對(duì)于疫苗免疫效果亦有顯著提升作用。本研究使用PCV2全病毒滅活抗原，與市場(chǎng)應(yīng)用良好的佐劑和抗原穩(wěn)定劑乳化制備疫苗，在小鼠上進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)，目的是篩選出能夠更好地增強(qiáng)PCV2滅活疫苗免疫效果的佐劑和組合，為疫苗的開(kāi)發(fā)及效果優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 抗原

豬圓環(huán)病毒2型滅活抗原，豬圓環(huán)病毒檢測(cè)用Cap蛋白，由某疫苗企業(yè)饋贈(zèng)。豬圓環(huán)病毒PCV2滅活疫苗，購(gòu)自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑

佐劑 1（ISA 206）、佐劑 2（ISA 201），由法國(guó)SEPPIC公司提供；雙相佐劑3、4，由國(guó)內(nèi)佐劑公司提供；水包油佐劑5，由國(guó)內(nèi)某佐劑公司提供?？乖€(wěn)定劑，市售。TMB單組份顯色液、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 滅活疫苗的制備

將滅活圓環(huán)病毒抗原與5種佐劑按照合適比例混合，按照各自佐劑使用方法（保證各組抗原含量相同，不足部分使用滅菌PBS補(bǔ)齊體積），在最優(yōu)條件下乳化配苗，分別標(biāo)記為1-1組、2-1組、3-1組、4-1組、5-1組。同時(shí)將抗原穩(wěn)定劑A按照0.5%的比例加入到抗原相中，再乳化配苗，分別標(biāo)記為1-2組、2-2組、3-2組、4-2組、5-2組。共10組疫苗。

1.5 小鼠免疫分組

將120只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成12組，每組10只。上述10組疫苗，0.2 mL/只。同時(shí)設(shè)置第6組為空白實(shí)驗(yàn)組，注射PBS 0.2 mL；第7組為“勃林格”疫苗對(duì)照組，0.1 mL/只。免疫后0 d、14 d、21 d、28 d，小鼠眼球采血測(cè)定其ELISA抗體水平。

1.6 間接ELISA方法

以碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，100 μL/孔于4℃包被過(guò)夜；純化水洗板3次，加入封閉液200 μL/孔，37℃封閉2 h，純化水洗板3～5次，自然晾干。用樣品稀釋液稀釋待檢驗(yàn)鼠血清，100μL/孔加入酶標(biāo)板中，37℃作用60 min，取出后PBST洗滌3～5次，拍干；加入酶標(biāo)抗體工作液，37℃作用60 min，洗滌3～5次，拍干；加入TMB顯色液，100μL/孔，室溫避光反應(yīng)10 min后，加入終止液50μL/孔；酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。檢測(cè)孔與陰性對(duì)照孔OD450nm值比率大于或等于2.1的最高稀釋度的倒數(shù)為該血清的抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 物理性狀

制備的10組疫苗，外觀均呈現(xiàn)乳白色均質(zhì)乳劑；37℃靜置3 d、25℃靜置14 d均未出現(xiàn)分層及破乳現(xiàn)象；3 000 rpm離心15 min穩(wěn)定性合格。

2.2 5種佐劑對(duì)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效果的影響

表1 不同佐劑制備的圓環(huán)病毒疫苗免疫小鼠后的血清抗體水平

由表1可知，不同佐劑制備的豬圓環(huán)病毒滅活疫苗，免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體水平存在顯著差異（P＜0.05）。對(duì)比1-1和2-1組結(jié)果可知，ISA 201佐劑產(chǎn)生的抗體水平顯著高于ISA 206（P＜0.05）；同時(shí)市售佐劑3和佐劑4，免疫效果差異顯著（P＜0.05），佐劑3可達(dá)到ISA 201水平，佐劑4免疫效果較ISA 206略差；佐劑5免疫效果介于佐劑2和佐劑3之間，說(shuō)明水包油劑型佐劑應(yīng)用于圓環(huán)病毒疫苗，免疫效果也比較理想。

2.3 抗原穩(wěn)定劑對(duì)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效果的影響

表2 抗原穩(wěn)定劑對(duì)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗效果的影響

對(duì)比表1和表2結(jié)果，對(duì)于佐劑1/3/5而言，抗原穩(wěn)定劑的使用可以顯著提高小鼠血清抗體水平，效果差異顯著。對(duì)于佐劑2/4而言，抗原穩(wěn)定劑對(duì)于抗體水平的提升影響較小，差異不顯著。

3 討論

PCV2感染豬體后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，在一定程度上可以認(rèn)為，提高豬體對(duì)PCV2的體液免疫水平，有可能提升疫苗的臨床使用效果，增強(qiáng)機(jī)體抵抗PCV2感染的能力。同樣研究表明滅活疫苗確實(shí)具有較好的免疫保護(hù)作用。不同免疫佐劑和抗原穩(wěn)定劑的配比，對(duì)于疫苗的免疫效果發(fā)揮的作用至關(guān)重要。本文對(duì)比了5種市場(chǎng)上常見(jiàn)的水性佐劑和1種常見(jiàn)的抗原穩(wěn)定劑，對(duì)PCV2滅活疫苗免疫效果的影響，目的是找到免疫效果比較理想的組合和配比，為滅活疫苗的開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)支持。

本研究中使用市場(chǎng)上應(yīng)用效果較好的“勃林格”圓環(huán)病毒疫苗作為對(duì)照，通過(guò)對(duì)比小鼠血清中ELISA抗體水平，可以看出抗體水平在一定程度上反映出疫苗的免疫效果。本研究中使用不同的佐劑乳化PCV2滅活抗原免疫BALB/c小鼠后，測(cè)定小鼠血清中ELISA抗體水平，佐劑2、3、5產(chǎn)生的抗體水平顯著超過(guò)其他試驗(yàn)組，說(shuō)明這3種佐劑能夠更好地誘發(fā)小鼠體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)開(kāi)展抗原穩(wěn)定劑驗(yàn)證試驗(yàn)，與佐劑3和佐劑5復(fù)配使用，抗體水平顯著提升，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型高效的豬圓環(huán)病毒滅活疫苗，可以提供一定的數(shù)據(jù)參考。另外，本試驗(yàn)未在靶動(dòng)物豬上開(kāi)展效力性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，可能無(wú)法真實(shí)反映在臨床上的實(shí)際應(yīng)用效果，以后有待于在豬體上進(jìn)行更深入的研究。