王 警,鄭娟梅,王海波,莫紫梅,陳寧周

(廣西-東盟食品檢驗檢測中心,廣西南寧 530021)

近年來,由于我國經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展及消費者消費能力的增強,飲料市場的增長及需求保持強勁態(tài)勢[1]。食品添加劑作為飲料工業(yè)中不可或缺的一部分,其安全性也越來越受到消費者的關注[2-5]。由于我國食品結構的特殊性和相應法律法規(guī)的不健全,某些不良廠商通過超范圍、超量使用添加劑,甚至將一些非食品添加劑加入到食品中以謀求更高的經(jīng)濟利益,對人們的健康造成嚴重的影響。飲料中常用的食品添加劑包括甜味劑、防腐劑和著色劑等[6]。據(jù)相關報道,甜味劑超量使用時,會對人體產(chǎn)生毒副作用,例如,大量糖精進入人體,會引起血小板減少,容易導致急性大出血,引發(fā)惡性事件;甜蜜素的過量使用會有致癌癥、致畸形和致肝損等不良反應[7-10]。食品中若過度添加了合成色素,對人體有一定的危害,尤其是偶氮類人工合成色素,在人體內(nèi)經(jīng)過肝臟等器官可以轉(zhuǎn)換成芳香胺化合物,芳香胺化合物在體內(nèi)經(jīng)過代謝活動后與靶細胞作用而可能引起癌癥[11-14]。我國常用的防腐劑有苯甲酸、山梨酸等。苯甲酸鈉進入人體后會與胃酸反應生成苯甲酸[15],苯甲酸對人體具有毒副作用,因為已有苯甲酸及其鈉鹽蘊積中毒的報道,歐共體兒童保護集團認為它不宜用于兒童食品中,日本也對它的使用做出了嚴格限制。山梨酸毒性較苯甲酸低,殺菌能力較苯甲酸強,但過量攝入也會影響人體的新陳代謝[16-18]。

食品添加劑的主要檢測技術有紫外-可見分光光度法[19-20]、氣相色譜法[21-23]、液相色譜法[24-27]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[28-30]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[31-32]等。紫外-可見分光光度法利用物質(zhì)對光的吸收光譜,對物質(zhì)進行定性或者定量。但是樣品溶液的濃度、穩(wěn)定性會對結果造成較大的干擾,準確度相對不高。氣相色譜法適用于易揮發(fā)和化學性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì),而對沸點較高、不揮發(fā)物質(zhì)則難以進行定性和定量分析,大大縮小了其可檢測物質(zhì)的種類。液相色譜法存在靈敏度低、抗干擾能力差等缺點,容易出現(xiàn)假陽性。雖然GC-MS技術是當前測定食品添加劑較為常用的技術,但是由于部分食品添加劑(著色劑、甜味劑等)本身的不易揮發(fā)性,在測定過程中需要對目標物衍生化,從而使測定過程復雜、檢測靈敏度降低,并且基質(zhì)干擾嚴重,對最終結果造成影響。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的適用范圍比GC-MS更加廣泛,分析效率高,兼具定性定量功能,有效防止假陽性,尤其適宜于復雜基質(zhì)的定性和定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲醇 色譜純,Thermo Fisher Scientific公司;乙酸銨、甲酸銨、甲酸 色譜純,德國Sigma公司;聚四氟乙烯濾膜(PTFE,0.22 μm)、尼龍66濾膜(0.22 μm) 上海安譜實驗科技股份有限公司;聚丙烯濾膜(GHP,0.22 μm)、聚四偏氟乙烯濾膜(PVDF,0.22 μm) 美國Waters公司;聚醚砜濾膜(PES,0.22 μm) 津騰實驗設備有限公司;山梨酸、阿力甜、安賽蜜、三氯蔗糖、檸檬黃、靛藍、日落黃、橙黃G、孟加拉紅、麗春紅3R 北京曼哈格生物科技有限公司;苯甲酸、糖精鈉、脫氫乙酸、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、新紅、赤蘚紅、胭脂紅、誘惑紅、亮藍、喹啉黃、酸性橙、酸性綠50、熒光桃紅、熒光素鈉、羅丹明B、堿性橙2、酸性藍3、酸性紅G 德國Dr. Ehrenstorfer 公司;非蛋白飲料樣品 南寧某超市。

AB SCIEX TRIPLE QUAD 4500高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX 公司;Milli-Q超純水器 美國Millipore公司;XS205DU型電子天平 美國Mettler toledo公司;S180H型超聲波清洗機(超聲頻率37 kHz) 德國Elma公司;Heidolph Multi Reax型多管式渦旋振蕩器 德國Heidolph公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 單個標準儲備液的配制 精密稱取30種食品添加劑對照品0.5000 g,用50%甲醇溶液定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的單個標準儲備液,于4 ℃冷藏。

1.2.1.2 一級混合標準工作溶液的配制 分別吸取1.00 mL單個標準儲備液置于同一100 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,即得質(zhì)量濃度為500 μg/mL的一級混合標準工作溶液,于4 ℃冷藏。

1.2.1.3 二級混合標準工作溶液的配制 吸取1.00 mL一級混合標準工作溶液置于50 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的二級混合標準工作溶液,于4 ℃冷藏。

1.2.1.4 混合標準曲線溶液的配制 準確吸取0.02、0.05、0.10、0.15、0.2、0.4、1.00 mL的二級混合標準工作溶液,分別置于10 mL容量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度,得到質(zhì)量濃度為20、50、100、150、200、400、1000 ng/mL的系列混合標準曲線溶液。

1.2.2 樣品前處理 準確稱量(1.00±0.01) g樣品置于50 mL容量瓶中,然后加入10 mL 50%甲醇,渦旋后在超聲下提取5 min,冷卻至室溫,用50%甲醇定容。移入離心管中,4000 r/min離心5 min,吸出上清液用0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾,濾液即可上機測定。

城市政府作為城市規(guī)劃中決策規(guī)則的制定者與實際決策權力的掌權者，其領導與核心地位不可動搖。城市政府作為法定決策機構，在城市更新中對于信息的掌控有無與倫比的優(yōu)勢。在很大程度上，城市政府擁有著對于規(guī)劃方案科學性及嚴肅性的壟斷，即確定城市更新方案基本上以城市政府的意志為準。然而，在市場化的決策環(huán)境下，城市政府受到各利益主體影響的可能性也在增強，應格外防止 “尋租”以及與利益開發(fā)商的“合謀”。

1.2.3 色譜條件 Atlantis T3色譜柱(2.1×150 mm,3 μm):美國Waters 公司;流動相:A:10 mmol/L乙酸銨水溶液;B:乙腈;流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL。高效液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離模式:電噴霧電離(ESI),正負離子同時進行;采集數(shù)據(jù)模式:多反應監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓:-4500、5500 V;氣體:氮氣,純度 ≥ 99.99%;氣簾氣壓力(CUR):35 Psi;霧化氣(GS1):50 Psi;輔助氣(GS2):50 Psi;碰撞氣壓力(CAD):6.0 Psi;離子源溫度:650 ℃;其他條件見表2。

表2 優(yōu)化的30種食品添加劑的多反應監(jiān)測參數(shù)Table 2 The optimum parameters of MRM for 30 food additives

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0和Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的優(yōu)化

本實驗同時進行30種食品添加劑的分離,對色譜柱的要求比較高。本研究中考察了3種規(guī)格的C18色譜柱對目標物的分離能力,包括Atlantis T3色譜柱(2.1×150 mm,3 μm),Ultimate XB-C18色譜柱(2.1×100 mm,3 μm)和Kinetex C18色譜柱(2.1×100 mm,2.6 μm)。如圖1所示,Kinetex C18色譜柱對于檸檬黃、新紅、靛藍、喹啉黃、胭脂紅等著色劑的分離效果較差。Ultimate XB-C18色譜柱能夠?qū)χ珓崿F(xiàn)較好的分離,但檸檬黃、安賽蜜以及苯甲酸的展寬嚴重,峰形較差。Atlantis T3色譜柱(2.1×150 mm,3 μm)與上述兩種色譜柱比較對30種食品添加劑的分離效果較好。

圖1 三種不同規(guī)格色譜柱分離30種食品添加劑對照品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards of 30 food additives separated by three kinds of chromatogram column注:1:檸檬黃;2:安賽蜜;3:苯甲酸;4:新紅;5:山梨酸;6:靛藍;7:脫氫乙酸;8:糖精鈉;9:喹啉黃;10:胭脂紅;11:甜蜜素;12:日落黃;13:誘惑紅;14:橙黃G-2;15:酸性紅G;16:阿斯巴甜;17:三氯蔗糖;18:亮藍;19:阿力甜;20:酸性綠50;21:麗春紅3R;22:熒光素鈉;23:赤蘚紅;24:熒光桃紅;25:酸性橙7;26:酸性藍3;27:紐甜;28:孟加拉紅;29:堿性橙2;30:羅丹明B。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實驗采用流動注射泵直接進樣方式,分別對30種目標分析物的標準溶液(1 μg/mL)進行進樣分析。在全掃描(Q1MS)模式選擇響應高,接近目標物分子電離方式的母離子,隨后比較目標分析物母離子在正、負離子模式下的響應程度,最后主要選取m/z響應最高的作為定量離子。監(jiān)測結果顯示,苯甲酸、檸檬黃等26種添加劑在負離子電離模式下響應度較高,而赤蘚紅、喹啉黃等4種添加劑在正離子電離模式下響應程度較高。在對應的電離方式下,通過優(yōu)化母離子的去簇電壓(DP),并在子離子(product Ion(MS2))模式下選擇兩個響應度較高的子離子,在多反應監(jiān)測(MRM)模式下對不同目標化合物的碰撞能量(CE)進行了優(yōu)化。

2.3 流動相優(yōu)化

本研究中30種添加劑性質(zhì)相差較大,對色譜條件要求極為苛刻。為了達到最佳的色譜分離,考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-乙酸銨水3種流動相體系對30種目標分析物色譜分離的影響。甲醇-水體系對于喹啉黃等著色劑,普遍存在峰形展寬,嚴重拖尾和重疊峰等現(xiàn)象,對于目標物的定量存在嚴重干擾;當選用乙腈水體系,即純乙腈為流動相的有機相時,大多數(shù)目標物出峰時間提前,安賽蜜、檸檬黃和糖精鈉的出峰時間過早,在測定過程中容易受雜質(zhì)干擾,難以實現(xiàn)定性定量分析;選用乙腈-乙酸銨水體系,色譜分離度好,質(zhì)譜響應度高,滿足檢測靈敏度的要求。通過考察20、10 mmol/L乙酸銨兩種濃度對目標分析物的影響,并綜合目標化合物的pKa值、電離和加氫方法、色譜分離效率和鹽濃度等因素對質(zhì)譜系統(tǒng)的影響,最后選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨作為流動相,能夠達到最佳分離效果。30種混合標準品(濃度為100 ng/mL)的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)見圖2。

圖2 30種食品添加劑對照品溶液的總離子流圖Fig.2 TIC of 30 standard food additive solutions

2.4 樣品前處理優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的考察 考察了50%、70%、90%甲醇水溶液,50%、70%、90%乙腈水溶液六種不同提取溶劑對樣品提取效率的影響,空白基質(zhì)加標值為10 mg/kg,平行測定6次。結果見表3,六種提取溶劑對各組分回收率無明顯區(qū)別?？紤]與標準曲線配制的一致性和操作的便利性,選擇使用50%甲醇水溶液作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑下各組分的回收率(%,n=6)Table 3 Average recoveries of each component after different extraction solvent(%,n=6)

2.4.2 濾膜的考察 考察了聚四氟乙烯濾膜(PTFE)、尼龍66濾膜、聚丙烯濾膜(GHP)、聚四偏氟乙烯濾膜(PVDF)、聚醚砜濾膜(PES)5種濾膜對30種化合物的對照品溶液的吸附作用。分別取混合標準曲線溶液(200 ng/mL)約1.5 mL,依次通過PTFE、尼龍66、GHP、PVDF、PES濾膜,棄去初濾液0.5 mL,收集到進樣小瓶中,用于濾膜考察。每份樣品重復測定3次。實驗結果見表4,表明尼龍66濾膜對絕大部分著色劑的吸附能力強;PVDF濾膜對部分著色劑吸附能力強;PES濾膜對熒光桃紅和胭脂紅具有較強的吸附能力;GHP濾膜對部分著色劑(橙黃G、胭脂紅、靛藍)及部分防腐劑(山梨酸)具有吸附作用;PTFE濾膜對熒光桃紅和檸檬黃具有一定的吸附力。綜合考慮目標化合物的理化性質(zhì),雜質(zhì)的干擾以及對色譜柱的保護等因素,最后選擇PTFE濾膜作為樣品前處理用濾膜。計算方式按照下列公式:

表4 標準溶液經(jīng)不同濾膜過濾后的各組分含量(%,n=3)Table 4 Contents of each component after standard solution filtration through different membranes(%,n=3)

續(xù)表

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線和基質(zhì)效應 基質(zhì)效應(ME,matrix effect)普遍存在于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測中,表現(xiàn)為離子增強效應或離子抑制效應,從而導致定量結果有一定的偏差。基質(zhì)效應可以用ME(%)=B/A×100計算,式中B為基質(zhì)曲線斜率,A為標準曲線斜率。當ME>100%時,基質(zhì)存在離子化增強作用;當ME<100%時,基質(zhì)存在離子化抑制作用[33]。實驗分別配制兩組標準曲線:曲線A,直接用50%甲醇將混合標準工作液稀釋成標準曲線工作溶液;曲線B,用空白飲料樣品提取液做稀釋液配制標準曲線溶液。如表5所示,在0.02～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi),兩種曲線的線性相關系數(shù)均大于0.990。大部分食品添加劑表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應,只有安賽蜜、甜蜜素、阿力甜和紐甜4種添加劑表現(xiàn)出基質(zhì)增強效應。基質(zhì)效應值在85%～115%內(nèi),基質(zhì)效應不明顯[34-36],因此本文采用50%甲醇水溶液配制標準曲線。

表5 30種食品添加劑的線性及相關系數(shù)r、平均回收率、RSD(n=6)和檢出限Table 5 Linearity and correlation coefficients,average recovery,RSD and detection limit(n=6)of 30 food additives

續(xù)表

續(xù)表

2.5.2 回收率和精密度 以空白飲料基質(zhì)為樣品,在5.0、7.5和10.0 mg/kg 3個水平下進行加標回收實驗,平行測定6個樣品,計算加標回收率,結果見表5。取最低添加水平5.0 mg/kg,上機檢測,得到儀器信噪比(S/N),檢出限=添加水平×3/信噪比,結果見表5。

2.6 實際樣品的檢測

應用本方法對20件購自超市的非蛋白飲料樣品(包括碳酸飲料、果蔬汁飲料、風味飲料)進行分析,共檢出苯甲酸陽性樣品3個,檢出值分別為110、120、112 mg/kg;山梨酸陽性樣品3個,檢出值分別為670、210、87 mg/kg;安賽蜜陽性樣品2個,檢出值分別為140、93 mg/kg;甜蜜素陽性樣品2個,檢出值分別為450、365 mg/kg;紐甜陽性樣品1個,檢出值為9.6 mg/kg;檸檬黃陽性樣品1個,檢出值為1.3 mg/kg。根據(jù)國標GB 2760-2014中對各類飲料食品添加劑的使用限量標準,以上陽性樣品檢出值均在限量范圍內(nèi),符合國家標準要求。

3 結論

本實驗利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了非蛋白飲料中30種食品添加劑的檢測方法。30種食品添加劑在20～1000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好,線性相關系數(shù)大于0.990。該方法的檢出限為29～441 μg/kg,空白樣品加標回收率在73.50%～117.60%,精密度為0.35%～15.37%。該方法具有簡單、快速、準確等特點,可以對非蛋白飲料樣品中的目標化合物進行準確定性和定量分析,滿足相關食品添加劑的國家標準要求。與此同時,本實驗還建立了30種食品添加劑(防腐劑、著色劑、甜味劑)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,適合食品添加劑的快速篩查。