郭 燕， 尹丹丹， 胡付品， 高晶晶， 何麗華， 吳文娟， 孫景勇， 倪語星， 湯 瑾，余佳佳， 劉 瑛， 田東興， 張 泓， 劉文健， 趙 虎， 李 敏

碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染最有效的藥物之一[1]。隨著臨床上碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌的出現(xiàn)及在全球的流行播散，該類耐藥細(xì)菌已成為威脅人類健康的全球重大公共衛(wèi)生問題。由于產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌及一些多重耐藥銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素類抗菌藥物耐藥率低，本類藥物重新成為多重耐藥革蘭陰性桿菌感染治療的選用藥物之一。對(duì)于黏菌素或多黏菌素B的藥敏試驗(yàn)，當(dāng)前歐洲共同體藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）和美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）僅推薦肉湯微量稀釋法可作為測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC）的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)方法[2]，但由于該藥敏方法在醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室尚難以開展，目前還在采用其他方法檢測(cè)多黏菌素的藥敏。為了解這些方法與標(biāo)準(zhǔn)肉湯微量稀釋法的差異，本次多中心研究納入上海市8所三級(jí)醫(yī)院，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)收集非重復(fù)的臨床上碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌統(tǒng)一進(jìn)行方法學(xué)比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌來源 收集2018年9月1日－12月31日上海市8所教學(xué)醫(yī)院（包括7所綜合性醫(yī)院和1所兒童醫(yī)院）的臨床分離碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌1 040株，具體菌種和菌株數(shù)見表1，剔除同一患者相同部位重復(fù)菌株。中心實(shí)驗(yàn)室在此期間將收集到的所有細(xì)菌復(fù)核鑒定確認(rèn)后凍存于-80 ℃冰箱，待試驗(yàn)開始時(shí)從低溫冰箱取出，復(fù)蘇和轉(zhuǎn)種后進(jìn)行試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 黏菌素（批號(hào)130327-200906，效價(jià)22740 UNITs/mg）和多黏菌素B（批號(hào)130313-201310，效價(jià)7791 UNITs/mg）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 藥敏試紙 ①多黏菌素B MIC測(cè)試條（MIC Test Strip，MTS）試紙系意大利利飛馳公司產(chǎn)品，測(cè)定的濃度范圍為0.06～1 024 mg/L；②多黏菌素B梳狀條（E strip）系溫州康泰公司產(chǎn)品，測(cè)定的濃度范圍為0.064～256 mg/L；③黏菌素E試驗(yàn)條系法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，測(cè)定的濃度范圍為0.016～256 mg/L；④黏菌素和多黏菌素B紙片系英國OXOID公司產(chǎn)品。

1.1.4 VITEK 2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀 革蘭陰性菌中國定制藥敏卡N335系法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，測(cè)定的濃度范圍為0.5～16 mg/ L。

1.1.5 培養(yǎng)基和試劑 Mueller-Hintor瓊脂（MHA）為英國OXOID公司產(chǎn)品。肉湯微量稀釋法藥敏試驗(yàn)用的陽離子調(diào)節(jié)肉湯（cation adjusted Mueller-Hinton broth， CAMHB）為美國BBL公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)方法 肉湯微量稀釋法按2018年CLSI M07-A11[3]（需氧菌的抗菌藥物稀釋法敏感性試驗(yàn)）推薦的微量稀釋法進(jìn)行，在本研究中為藥敏試驗(yàn)方法學(xué)比較的參考方法（金標(biāo)準(zhǔn)）。紙片擴(kuò)散法和各類試條的梯度擴(kuò)散法按CLSI M02- A13[4]（抗菌藥物紙片敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)）推薦；VITEK 2-Compact及N335板卡按制造商說明書要求進(jìn)行。

1.2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)[5]①基本一致率（essential agreement， EA）：被評(píng)估的方法檢測(cè)獲得的MIC與肉湯微量稀釋法獲得的MIC值相差±1個(gè)稀釋度的菌株百分比；②分類一致率（categorical agreement，CA）：按照折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，與參考方法相比，兩者獲得的敏感、中介、耐藥結(jié)果完全一致菌株的百分比；③小誤差（minor error，mE）：菌株在同一折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)下，評(píng)估方法將金標(biāo)準(zhǔn)方法做出的中介菌株判定為敏感或耐藥；④重大誤差（major errors，ME）：即評(píng)估方法將金標(biāo)準(zhǔn)方法做出的敏感菌株判定為耐藥（假耐藥）；⑤非常重大誤差（very major errors，VME）：即評(píng)估方法將金標(biāo)準(zhǔn)方法做出的耐藥菌株判定為敏感（假敏感）；⑥可接受誤差范圍為：EA和CA均 ≥90%、mE≤10%、ME≤3%和VME≤1.5%。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用WHONET 5.6軟件[6]進(jìn)行藥敏結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。折點(diǎn)可按CLSI M100（2019年版）的推薦[7]。如黏菌素為敏感≤2 mg/ L，耐藥≥4 mg/L；但多黏菌素B對(duì)銅綠假單胞菌敏感 ≤2 mg/L，中介4 mg/L，耐藥≥8 mg/L；對(duì)不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌敏感≤2 mg/L，耐藥≥4 mg/ L。C L S I目前沒有腸桿菌科細(xì)菌折點(diǎn)推薦，但其推薦流行病學(xué)界值（E C V）可判斷野生型（≤2 mg/ L）和非野生型（≥4 mg/L）。紙片法結(jié)果可分別采用CLSI M100（2016年版）[8]黏菌素（敏感≥11 mm，耐藥≤10 mm）和多黏菌素B（敏感≥12 mm，耐藥≤10 mm）對(duì)銅綠假單胞菌的折點(diǎn)進(jìn)行判讀。

2 結(jié)果

2.1 黏菌素藥敏試驗(yàn)方法結(jié)果比較

肉湯微量稀釋法、E試驗(yàn)法、V I T E K 2-Compact和紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，377株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）對(duì)黏菌素的敏感率分別為97.3%、97.1%、96.3%和98.1%。317株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（CRPA）對(duì)黏菌素的敏感率分別為100%、95.3%、100%和99.1%。346株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）對(duì)黏菌素的敏感率分別為99.7%、100%、99.7%和99.7%。見表1。

與標(biāo)準(zhǔn)方法肉湯微量稀釋法結(jié)果相比，E試驗(yàn)法檢測(cè)CRKP、CRPA和CRAB藥敏的EA分別為87.3%、88.3%和67.9%，E試驗(yàn)法、VITEK 2-Compact和紙片擴(kuò)散法檢測(cè)上述菌株的CA均 ＞95%。見表2～表4、圖1～圖3。

2.2 多黏菌素B藥敏試驗(yàn)方法結(jié)果比較

肉湯微量稀釋法、MTS、E strip和紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，377株CRKP對(duì)多黏菌素B的敏感率分別為98.1%、97.3%、97.3%和99.2%。317株CRPA對(duì)多黏菌素B的敏感率分別為100%、98.7%、99.4%和99.7%。346株CRAB對(duì)多黏菌素B的敏感率分別為99.7%、100%、100%和99.7%。見表1。

與標(biāo)準(zhǔn)方法肉湯微量稀釋法結(jié)果相比，MTS和E strip檢測(cè)CRKP、CRPA、CRAB的EA分別為13.8%和60.5%、65.0%和95.0%、31.8%和79.2%；而MTS、E strip和紙片擴(kuò)散法檢測(cè)上述菌株的CA均＞98%。見表5～表7、圖4～圖6。

3 討論

2019年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為14.1%和13.5%、31.5%和26.7%、79.9%和80.4%，與2018年資料相比有增長趨勢(shì)[9]。碳青霉烯類耐藥的革蘭陰性菌使臨床抗感染治療面臨重大挑戰(zhàn)，WHO將其列入病原菌危險(xiǎn)分類清單“嚴(yán)重致命”級(jí)別[10]。多黏菌素作為治療這類多重耐藥革蘭陰性菌感染的“重要藥物”，實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確地測(cè)定其藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床聯(lián)合抗菌藥物選擇至關(guān)重要。

表1 各種方法測(cè)定黏菌素和多黏菌素B的MIC分布Table 1 Distribution of colistin and polymyxin B MICs as determined by different metheds

目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室主要常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法為自動(dòng)化儀器。本研究結(jié)果顯示，VITEK 2-Compact法檢測(cè)317株CRPA和346株CRAB對(duì)黏菌素的藥敏，VME和ME均為0；而對(duì)于CRKP，VITEK 2-Compact法的CA為98.4%，但假敏感率為1/9，不在誤差可接受范圍內(nèi)。Dafopoulou等[11]報(bào)道，采用VITEK 2-Compact法檢測(cè)41株碳青霉烯類不敏感肺炎克雷伯菌結(jié)果，VME為0，可推薦用作藥敏測(cè)定方法。然而2017年Chew等[12]采用相同儀器法檢測(cè)76株腸桿菌科的VME高達(dá)36%，認(rèn)為誤差不可接受?？梢姡琕ITEK 2-Compact法檢測(cè)CRKP結(jié)果存在較大差異。

圖1 黏菌素E試驗(yàn)、VITEK 2-Compact、紙片擴(kuò)散法和肉湯微量稀釋法測(cè)定377株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 377 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表2 不同方法測(cè)定碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)黏菌素敏感性結(jié)果一致性比較Table 2 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by different methods

圖2 黏菌素 E試驗(yàn)、VITEK 2-Compact、紙片擴(kuò)散法和肉湯微量稀釋法測(cè)定317株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 317 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

表3 不同方法測(cè)定碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌對(duì)黏菌素敏感性結(jié)果一致性比較Table 3 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa by different methods

圖3 黏菌素 E試驗(yàn)、VITEK 2-Compact、紙片擴(kuò)散法和肉湯微量稀釋法測(cè)定346株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌散點(diǎn)圖Figure 3 Scatter plot comparing the MIC values of colistin determined by Etest and VITEK 2-Compact， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 346 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表4 不同方法測(cè)定碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)黏菌素敏感性結(jié)果一致性比較Table 4 Discrepancy rates in the susceptibility of colistin against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii by different methods

圖4 多黏菌素B MTS、 E strip、紙片擴(kuò)散法和肉湯微量稀釋法測(cè)定377株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌散點(diǎn)圖Figure 4 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diametersof disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 377 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表5 不同方法測(cè)定碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)多黏菌素B敏感性結(jié)果一致性比較Table 5 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by different methods

圖5 多黏菌素B MTS、E strip、紙片擴(kuò)散法和肉湯微量稀釋法測(cè)定317株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌散點(diǎn)圖Figure 5 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 317 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa

表6 不同方法測(cè)定碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌對(duì)多黏菌素B敏感性結(jié)果一致性比較Table 6 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa by different methods

E試驗(yàn)法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果定量，但在臨床實(shí)驗(yàn)室開展較少。E試驗(yàn)法檢測(cè)CRKP和CRAB的VME分別為1/9和1/1，而CRPA的VME為0，其總體ME為4.7%。據(jù)不同報(bào)道，E試驗(yàn)法的VME從9.1%到55.5%不等[13-14]，均明顯高于CLSI誤差接受標(biāo)準(zhǔn)1.5%，本研究結(jié)果與之相似。MTS法和E strip法檢測(cè)原理、操作步驟與E試驗(yàn)法相似，簡(jiǎn)單且可獲得MIC值。本研究中，MTS法和E strip法檢測(cè)CRPA對(duì)多黏菌素B的敏感性、敏感率和CA均近100%，VME均為0， ME＜3%，而用于檢測(cè)CRKP和CRAB的VME分別為28.6%和33.3%，存在不可接受的假敏感率。Dafopoulou等[11]采用MTS法檢測(cè)41株CRKP和20株CRAB對(duì)黏菌素的藥敏，檢出的VME亦高達(dá)34.1%和25%。

紙片擴(kuò)散法成本低，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果重復(fù)性好，廣泛用于微生物實(shí)驗(yàn)室。由于目前無黏菌素和多黏菌素B的紙片法折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，為便于統(tǒng)計(jì)分析，本研究采用2016年CLSI標(biāo)準(zhǔn)中黏菌素和多黏菌素B對(duì)銅綠假單胞菌的折點(diǎn)進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示不同菌種間存在差異。采用2016年的折點(diǎn)，紙片擴(kuò)散法檢測(cè)CRKP和CRAB的VME則高達(dá)33.3%～100%，均不可接受。Galani等[15]采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定黏菌素的藥敏，銅綠假單胞菌的VME為0；同樣的van der Heijden等[16]報(bào)道，CRPA對(duì)多黏菌素B的藥敏， VME高至100%。Gales等[17]采用敏感≥8 mm折點(diǎn)，黏菌素和多黏菌素B對(duì)革蘭陰性菌的VME為40%；采用敏感≥14 mm折點(diǎn)時(shí)，黏菌素的VME為23.3%。因此可見，紙片擴(kuò)散法由于折點(diǎn)原因檢測(cè)黏菌素和多黏菌素B的藥敏存在較多爭(zhēng)議。

圖6 多黏菌素B MTS、E strip、紙片擴(kuò)散法和肉湯微量稀釋法測(cè)定346株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌散點(diǎn)圖Figure 6 Scatter plot comparing the MIC values of polymyxin B determined by MTS and E strip， and the inhibition zone diameters of disk diffusion with the results of reference broth microdilution method when testing 346 strains of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表7 不同方法測(cè)定碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素B敏感性結(jié)果一致性比較Table 7 Discrepancy rates in the susceptibility of polymyxin B against carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii by different methods

本研究中，共發(fā)現(xiàn)11株黏菌素耐藥株，1株為鮑曼不動(dòng)桿菌，10株為肺炎克雷伯菌，其中1株鮑曼不動(dòng)桿菌和7株肺炎克雷伯菌對(duì)多黏菌素B耐藥，耐藥株經(jīng)復(fù)測(cè)結(jié)果保持一致。另外3株肺炎克雷伯菌對(duì)多黏菌素B敏感。根據(jù)國內(nèi)流行病學(xué)情況[18-19]，選擇黏菌素耐藥基因mcr-1和mcr-3引物對(duì)上述耐藥株進(jìn)行PCR分子生物學(xué)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性（數(shù)據(jù)未羅列）。提示醫(yī)院分離菌株的黏菌素耐藥除了質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr基因外，可能還有陰離子莢膜多糖結(jié)合、外排泵活化、異質(zhì)性耐藥等其他耐藥機(jī)制[20]。本研究尚未開展其他相關(guān)耐藥機(jī)制深入探索。

綜上所述，本研究中E試驗(yàn)法、V I T E K 2-Compact法、紙片擴(kuò)散法、MTS和E strip法等檢測(cè)碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌（CRKP、CRAB、CRPA）對(duì)黏菌素和多黏菌素B敏感性結(jié)果均存在EA偏低或假敏感現(xiàn)象（即VME），需引起實(shí)驗(yàn)室和臨床高度重視。實(shí)驗(yàn)室仍應(yīng)按CLSI相關(guān)文件采用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法進(jìn)行多黏菌素藥敏試驗(yàn)。此外，由于當(dāng)前關(guān)于多黏菌素的臨床治療研究資料有限，實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告多黏菌素藥敏試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)同時(shí)提供相關(guān)備注信息以提示臨床醫(yī)師，包括以下內(nèi)容：① 同時(shí)報(bào)告多黏菌素的MIC值及其解釋分類。② 備注以下警示信息，即黏菌素的MIC值可用于預(yù)測(cè)多黏菌素B的MIC值；如應(yīng)用黏菌素/多黏菌素B治療，應(yīng)根據(jù)腎功能給予最大推薦劑量。③ 臨床和PK/PD 數(shù)據(jù)證實(shí)黏菌素和多黏菌素B 臨床療效有限，應(yīng)聯(lián)合一個(gè)或多個(gè)有活性的抗微生物藥物。