周俊，趙成成，吳霄，石俊松，周榮，吳珍芳，李紫聰

研究報告

豬耳成纖維細胞轉錄組異質性及對核移植胚胎發(fā)育的潛在影響

周俊1，趙成成1，吳霄1，石俊松2，周榮2，吳珍芳1，李紫聰1

1. 華南農業(yè)大學動物科學院，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣州 510642 2. 廣東溫氏種豬科技有限公司，新興 527400

同一來源的供體細胞之間存在異質性。許多研究已經表明體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)效率與供體細胞有關。然而，鮮有在單細胞水平分析供體細胞異質性對核移植效率的潛在影響。本研究利用單細胞轉錄組測序技術對同一來源且隨機挑選的52個豬耳組織成纖維細胞進行測序分析。結果表明有48個單細胞的基因表達模式相似，4個單細胞(編號為D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2)的基因表達模式與其他單細胞存在較大的差異，并且不存在基因表達模式完全相同的兩個單細胞。以基因表達模式相似的48個單細胞作為對照，進一步分析了單細胞D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2的差異基因表達模式：首先利用R語言篩選4個單細胞的差異表達基因，并對前50差異表達基因進行匯總；然后對差異表達基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。富集分析發(fā)現差異表達基因的主要分子功能包括能量代謝、蛋白質代謝和細胞對刺激的反應等；主要通路包括KEGG中富集的與細胞周期、細胞代謝、DNA復制相關的通路。根據以上研究結果并結合SCNT研究進展討論了4個單細胞的差異基因表達模式對核移植胚胎發(fā)育效率的潛在影響。本研究揭示了豬耳組織成纖維細胞的轉錄組異質性，并提供了分析精英供體細胞的一種有效方法，為提高克隆效率帶來新的思路。

豬；體細胞核移植；供體細胞；異質性；單細胞測序

體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer, SCNT)又稱為體細胞克隆技術。1997年，英國胚胎學家Wilmut利用SCNT技術成功克隆出第一只哺乳動物—克隆羊“多莉”[1]，隨后，通過該技術先后誕生了牛()[2]、豬()[3]、猴()[4]等20余種哺乳動物。SCNT技術在保護瀕危物種[5]、優(yōu)秀種繁擴繁[6]以及再生醫(yī)學[7]等領域表現出巨大的應用價值，是生命科學研究的重要成果。但是，SCNT技術同樣面臨很多問題：以豬為例，體外培養(yǎng)條件下，囊胚率僅為20%左右，在不同品種或者卵母細胞質量差的情況下可能更低。即便胚胎成功附植，相較于體外受精(fertilization, IVF)胚胎，SCNT胚胎發(fā)育能力差、在受孕母豬體內發(fā)育異常的現象也十分普遍[8]。除此之外，大多數實驗條件下，克隆豬的出生率只有1%左右，遠低于人工授精(artificial insemination, AI)豬的出生效率(80%)[9]，嚴重限制了SCNT技術的應用和普及。SCNT技術基礎是將供體細胞移入去核的成熟卵母細胞中，最終發(fā)育成和供體細胞基因型相同的后代。因此供體細胞是影響體細胞核移植效率的關鍵因素。已有研究表明供體細胞會對SCNT效率產生影響：供體細胞的細胞周期[10]、傳代數[11]以及性別[12]的不同都會導致克隆胚胎發(fā)育效率出現差異。因此，選擇合適的供體細胞對提高SCNT胚胎發(fā)育效率十分重要。

供體細胞核在成熟的去核卵母細胞中異常的表觀遺傳重編程被認為是阻礙SCNT發(fā)育的主要原因[13,14]。而更容易被正確重編程的核供體細胞很可能是具有更大發(fā)育潛力的精英供體細胞。Zhai等[15]分別以豬骨髓間充質干細胞和豬胎兒成纖維細胞作為供體細胞進行核移植實驗，發(fā)現發(fā)育效率較高的骨髓間充質干細胞含有更多的有利于重編程的表觀遺傳標記和較少的抑制重編程的表觀遺傳標記，暗示容易被正確重編程的供體細胞在SCNT過程中會有更好的發(fā)育潛能。同時，Yamanaka等[16]在鼠源誘導多能干細胞研究中就已經提出精英供體細胞的概念：同一來源的細胞中會存在一些更容易被正確重編程、發(fā)育潛力更大的精英供體細胞；同樣，在克隆小鼠()的研究中也發(fā)現，與其他品系的小鼠相比，129小鼠的基因組狀態(tài)更不穩(wěn)定，更容易被激活或抑制。用野生基因型和129小鼠基因型雜交得到的重組細胞做供體，可顯著提高克隆動物的出生率[17]，說明精英供體細胞具有獨特的基因表達模式，只是其分子特征尚未探索清楚。另有研究顯示，從供體細胞遺傳而來的一些轉錄記憶可以導致克隆胚胎的發(fā)育缺陷[18]，表明供體細胞在一定程度上決定了重構胚胎的發(fā)育命運。供體細胞的異質性是指供體細胞在基因組或表型水平上具有的不同特征。同時，因為細胞之間異質性的存在，不同的供體細胞發(fā)育潛力是有差異的。即便同一來源的供體細胞也存在更有利于胚胎發(fā)育的精英供體細胞。但是在實際研究中，同一來源的供體細胞之間表型特征差異不明顯，分子層面的特征信息丟失嚴重，缺乏對常見供體細胞異質性的深入研究。

近年來，隨著測序技術的發(fā)展，特別是低輸入測序技術為體細胞核移植的研究提供了更多可能。而單細胞測序技術的誕生及發(fā)展[19~21]為人們進一步探究供體細胞之間的分子事件提供了便利。應用單細胞測序技術，可以以更精準的分辨率揭示供體細胞的異質性?；诖?，本研究對來源相同的52個豬耳組織成纖維細胞進行單細胞轉錄組測序分析，發(fā)現了48個基因表達模式相似的“普通”細胞，4個基因表達模式互不相似且都與“普通”細胞的基因表達模式存在顯著差異的“另類”細胞，揭示了豬耳組織成纖維細胞的轉錄組異質性，并結合已有研究結果討論了供體細胞轉錄組異質性對核移植效率的潛在影響，為后續(xù)通過深入研究尋找精英供體細胞來提高豬體細胞核移植效率提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

杜洛克公豬(373日齡)耳組織樣品由廣東溫氏食品集團華農溫氏股份有限公司提供；總RNA提取試劑盒SMART-SeqTMv4 UltraTMLow Input RNA Kit for Sequencing購于北京諾禾致源生物信息科技有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、氨基酸葡萄糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)、0.25%胰蛋白酶和乙二胺四乙酸均購自美國Gibco公司。單細胞轉錄組測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司在illumina平臺完成。圖片處理使用Photoshop 7.0/ACDSee 9.0軟件；spliced reads比對使用HISAT軟件[22]；聚類分析、基因差異表達分析、GO富集分析和主成分分析(principal component analysis, PCA)均采用R語言，其中聚類分析使用軟件包pheatmap，基因差異表達分析使用軟件包DEGSeq (1.12.0)[23]，富集分析采用軟件包GOseq[24]；KEGG富集使用軟件KOBAS (2.0)。

1.2 供體細胞單細胞培養(yǎng)與分離

將成年優(yōu)良杜洛克種公豬的耳組織樣品剪碎，用PBS洗滌兩次之后，在100 mm的培養(yǎng)皿上用手術刀和剪子切碎，先用DMEM重懸，再用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸消化1~2 h。將胰蛋白酶消化的細胞洗滌一次后，以300的離心率離心10 min，并將其接種于100 mm的細胞培養(yǎng)皿中，放入15% FBS和10 mg/L的青霉素–鏈霉素溶液的DMEM。在39℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6~8 d。然后移除未附著的組織塊，再將附著的細胞培養(yǎng)直至匯合，期間每隔3~7 d更換DMEM。最后利用顯微操作法，在體視顯微鏡下吸取單個細胞，放于盛有裂解液的去DNase-RNase的離心管中，用于單細胞轉錄組測序。

1.3 單細胞轉錄組數據獲得

1.3.1 總RNA提取

每個細胞樣品保存在6 μL SMART-SeqTMv4 kit裂解液(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)中。細胞樣品經過體積測量后，使用SMART-SeqTMv4 UltraTMLow Input RNA Kit for Sequencing試劑盒(美國Clontech公司)進行細胞裂解，提取總RNA，并保存在RNase-Free水中。

1.3.2 單細胞cDNA文庫構建及測序

對提取的總RNA直接進行First-stand cDNA的合成，然后對First-stand cDNA進行全長LD-PCR的擴增，利用AMPure XP beads純化擴增后的雙鏈cDNA (double-standed DNA, ds cDNA)，使用Qubit進行ds cDNA定量檢測；使用Covaris系統對ds cDNA進行超聲打斷，打斷后的雙鏈短片段進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads純化并選擇片段大小在200 bp左右的文庫；最后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。使用Qubit2.0對文庫進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，使用Agilent 2100對文庫的插入片段長度進行檢測。插入片段符合預期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求合并后進行HiSeq測序。本研究最后擴增成功且完成單細胞測序的樣品為52個，細胞樣品編號見表1。

1.4 單細胞轉錄組數據分析

1.4.1 測序數據質量控制

fastq格式的原始數據先通過內部perl腳本進行處理。在此步驟中，刪除包含適配器的reads、包含ploy-N的低質量的原始數據來獲得干凈的數據(clean reads)，同時對Q20、Q30和GC內容進行計算，所有的下游分析都是基于高質量的清潔數據。

表1 擴增成功并測序的單細胞樣品

1.4.2 差異基因表達分析

參考基因組和基因模型注釋文件直接從基因組網(http://www.ensembl.org/)下載。選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進行基因組定位分析。HISAT能夠有效的比對到RNA-Seq測序數據中的spliced reads，是目前比對率最高且最準確的比對軟件。先使用Hisat2 v2.0.4作為映射工具，它可以基于基因模型注釋文件生成一個拼接連接的數據庫，因此比其他非拼接映射工具具有更好的映射結果。然后使用軟件HTSeq v0.9.1計算映射到每個基因的讀取數字。然后根據基因的長度計算出每個基因的FPKM，并讀取到該基因的計數。在進行差異基因表達分析之前，通過edgeR程序包[25]對每一個序列庫標準化。利用R語言中的DEGSeq (1.20.0)軟件包進行微分表達式分析并繪制4個“另類”細胞差異基因火山圖、聚類軟件包pheatmap繪制4個“另類”細胞差異基因聚類圖。值用和法進行調整，修正的值為0.005和log2(fold change)為1，為顯著差異表達的閾值。

1.4.3 GO富集分析和KEGG通路分析

通過R語言中的GOseq軟件包對篩選得到的差異基因進行GO富集，展示差異基因在Gene Ontology (http://www.geneontology.org/)中的分布狀況，闡明本研究中不同細胞基因功能上的差異。

利用KOBAS(2.0)軟件對差異表達基因進行KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)通路統計，得到差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。其原理是應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的通路。

2 結果與分析

2.1 單細胞轉錄組測序揭示豬耳組織成纖維細胞間的異質性

按照PCA的前3個主要影響因素兩兩組合，對成功擴增且最終完成測序的52個單細胞進行主成分分析(圖1)，其中Dim1、Dim2、Dim3分別代表影響單細胞樣本在圖中相對位置的3個主要因素，相對位置較近的細胞表示基因表達模式相似。結果表明，D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2在圖1中的位置與其他單細胞相比較“離群”，說明這4個細胞的基因表達模式與其他單細胞存在較大差異。同時將52個耳組織成纖維細胞的基因表達總體情況繪制成熱圖(圖2)，結果表明，在同一來源的豬耳成纖維細胞中，同一基因在不同細胞間的表達情況并不相同，并不存在基因表達模式完全一致的兩個細胞，不同供體細胞之間存在轉錄組異質性。

2.2 D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2基因表達模式分析

將基因表達模式差異不明顯的“普通”細胞作為對照組，使用R語言中的軟件包DEGSeq (1.12.0)對D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2進行差異基因表達分析。D11_1與對照組比較，有1860個差異表達顯著的基因，其中上調表達的基因有458個，下調表達的基因有1402個；D12_1與對照組比較，有376個差異表達顯著的基因，其中上調表達的基因有109個，下調表達的基因有267個；DW61_2與對照組比較，有330個差異表達顯著的基因，其中上調表達的基因有277個，下調表達的基因有53個；DW99_2與對照組比較，有2225個差異表達顯著的基因，其中上調表達的基因有316個，下調表達的基因有1909個。使用R語言中軟件包DEGSeq (1.12.0)將4個“另類”細胞的差異基因的整體分布情況可視化(圖3)，使用R語言中的聚類軟件包pheatmap將4個“另類”細胞的差異基因整體表達情況可視化(圖4)。同時，將用軟件包DEGSeq (1.12.0)篩選出的D11_1、D12_1、DW61_1和DW99_2前50個差異最顯著的基因進行匯總：D11_1前50個差異最顯著的基因功能主要集中于細胞增殖分化過程中一些有機物質的合成與能量代謝過程(表2)；D12_1前50個差異最顯著的基因功能主要集中于蛋白質及葡萄糖轉運等過程(表3)；DW61_2前50個差異最顯著的基因功能比較多樣，但有個別基因涉及轉移酶活性(表4)；DW99_2前50個差異最顯著的基因功能主要集中于蛋白質編碼、核酸修復與能量代謝方面(表5)。

2.3 D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2差異基因GO富集分析和KEGG通路分析

對D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2測序得到的差異基因進行GO富集分析，這些差異基因在生物過程、細胞組分和分子功能方面的分布情況見圖5。D11_1上調的差異表達基因主要集中于與細胞代謝有關的線粒體等細胞器和細胞器膜，下調的差異表達基因主要涉及與細胞代謝有關的蛋白代謝和物質運輸生物過程。D12_1上調的差異表達基因無顯著富集，而下調的差異表達基因主要富集于細胞對刺激的反應與蛋白代謝的細胞過程與應對刺激信號傳導的膜的變化。DW61_2上調和下調的差異表達基因均無顯著富集。DW99_2上調的差異表達基因主要富集于細胞有絲分裂有關的DNA復制、染色體分離、核酸代謝等生物過程和與之相關的一些胞內有機物質的變化，而下調的差異表達基因則主要涉及蛋白代謝和蛋白修飾等一些高分子修飾過程。結果顯示D11_1和DW99_2的差異基因功能富集趨勢更為明顯，基因表達模式也更為“另類”。

圖1 52個單細胞轉錄組主成分分析

每個點代表一個單細胞樣品；橫、縱坐標軸的刻度是相對距離，無實際意義；Dim1、Dim2、Dim3后的百分比代表橫、縱的差異可以解釋全面分析結果的百分比。紅色圈出部分分別為單細胞D11_1、DW61_2、D12_1和DW99_2。

圖2 52個單細胞基因表達量熱圖

紅色代表基因高表達，藍色代表基因低表達。

圖3 D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2差異基因火山圖

A~D分別為D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2的差異基因火山圖；有顯著性差異表達的基因用紅色點(上調)和綠色點(下調)表示，無顯著性差異表達的基因用藍色點表示；橫坐標代表基因在不同樣本中表達倍數變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統計學顯著性；篩選標準padj < 0.05。

圖4 D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2差異基因聚類熱圖

整體FPKM層次聚類圖，將log10(FPKM+1)值進行歸一化轉換(scale number)并進行聚類，紅色表示高表達基因，藍色表示低表達基因。顏色從紅到藍，表示log10(FPKM+1)從大到小。

利用KEGG注釋系統對D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2進行差異基因代謝通路富集分析。結果顯示(圖6)，D11_1上調的基因主要作用于細胞代謝，而下調的基因主要作用于細胞凋亡；D12_1與DW61_2 KEGG均無顯著通路富集；DW99_2 KEGG通路中上調的差異基因最顯著的富集于調節(jié)DNA復制、細胞周期通路。

3 討論

單細胞轉錄組測序技術能夠揭示單個細胞的基因表達動態(tài)，反映細胞間的異質性。在豬耳成纖維細胞異質性研究過程中，將單個細胞從耳組織塊中分離出來是單細胞轉錄組測序的第一個關鍵步驟。為準確獲得成纖維細胞，排除其他類型細胞對細胞異質性結果的干擾，本研究最終采用顯微操作法進行單細胞分離。該方法適用于樣本數量少的單細胞樣品制備，能夠在顯微鏡下觀察成纖維細胞的形態(tài)，精準控制單個細胞的吸入與排出[26]，確保52個單細胞樣品均為成纖維細胞。

表2 D11_1前50個差異最顯著的基因信息

表3 D12_1前50個差異最顯著的基因概況

表4 DW61_2前50個差異最顯著的基因概況

表5 DW99_2前50個差異最顯著的基因概況

在生物界異質性通常被解釋為3個層面：(1)不同物種或生物體之間具有異質性；(2)同一生物體的不同器官或組織具有異質性；(3)同一器官或組織中的不同細胞具有異質性。事實上，早在1957年Novick等[27]就提出了細胞異質性的概念，最初是根據形態(tài)和功能上的差異將細胞群分化成不同的細胞亞群。單細胞測序技術的出現為細胞異質性的研究提供了全新的見解：每一個細胞都是獨特的個體，被獨一無二的DNA、RNA以及蛋白質所編碼[28]。在醫(yī)學領域，已有研究利用單細胞測序技術構建人類器官、組織的基因表達圖譜[29]。這為SCNT研究提供一個可能：應用單細胞測序技術描述供體細胞核和卵母細胞質相互作用的動態(tài)過程，以更高的分辨率解析阻礙胚胎發(fā)育的分子原因。在體細胞核移植研究中，由于供體細胞異質性的存在，不同的供體核和卵母細胞質相互作用表現出不同應答模式，包括不同的染色質重構和表觀遺傳修飾重編程[15]。同樣，在誘導多能干細胞的研究中，來自不同組織的供體細胞在重編程過程中表現出不同的敏感性[30,31]，由不同供體細胞獲得的多能干細胞擁有不同的轉錄模式[32]。先前大多數研究討論了不同類型的供體細胞對克隆胚胎發(fā)育效率的影響[33,34]，而尚不清楚來源相同的供體細胞異質性對核移植效率的影響。在實際研究中，往往把來源相同的供體細胞看成同質的，導致細胞內關鍵分子事件大量丟失。

圖5 D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2差異表達基因的GO富集分析圖

A~D分別為D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2與對照組差異表達基因的GO富集柱狀圖?？v坐標為富集的GO term，橫坐標為該term中差異基因個數。不同顏色用來區(qū)分生物過程、細胞組分和分子功能，帶“*”為顯著富集的GO term，對富集最顯著的30個GO term在圖中展示，如果不足30條，則全部展示。

圖6 D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2差異表達基因的KEGG富集散點圖

A~D分別代表D11_1、D12_1、DW61_2和DW99_2與對照組的差異表達基因KEGG富集散點圖?？v軸表示pathway名稱，橫軸表示Rich factor，點的大小表示此pathway中差異表達基因個數多少，而點的顏色對應于不同的value范圍。

本研究將精度對準細胞水平，用單細胞轉錄組數據反映不同供體細胞的基因表達模式：52個成功測序的豬耳成纖維細胞轉錄組熱圖反映同一組織供體細胞間的基因表達模式差異；通過對上述52個細胞進行主成分分析，發(fā)現 4個基因表達模式明顯不同的“另類”細胞，證實了供體細胞間異質性的存在。同時，推測“另類”細胞的基因表達模式和精英供體細胞存在聯系。D11_1與“普通”細胞相比，其上調基因GO富集于與細胞代謝相關的細胞器、細胞膜，尤其是線粒體，主要功能為促進細胞代謝。其下調基因在KEGG分析中主要集中在細胞凋亡通路。在正常受精胚胎中，精子來源的mtDNA在受精不久后被全部破壞，其mtRNA全部來源于卵母細胞[35]。但是在SCNT胚胎中卻存在供體來源的mtDNA[36]。因此，這些供體來源的線粒體DNA可能是影響克隆效率的關鍵線索。同時，D11_1差異基因表達結果也暗示了通過研究線粒體相關基因尋找精英供體細胞的可能。在D11_1表達上調的差異基因中，基因[37,38]可以調節(jié)精氨酸合成，而L-精氨酸又是細胞信號傳導、代謝功能分子(NO、多胺和肌酸)的主要合成前體[39]，對胚胎發(fā)育十分重要?；虻谋磉_能加快蛋白質代謝和高爾基體轉運，增加胚胎發(fā)育能力[40,41]。在D11_1表達下調的差異基因中，基因家族蛋白負向調節(jié)鞘脂代謝[42]，其下調表達會促進細胞生長分化；基因的表達可促進細胞凋亡[43,44]，其下調表達起到抑制細胞凋亡的作用；是一種介導表觀遺傳抑制修飾的多蛋白復合物[45]，可以推動細胞重編程障礙H3K9me3[46]的表觀抑制修飾，其下調表達有利于克隆胚胎正確重編程。因此，D11_1的基因表達模式可作為精英供體細胞的潛在參考。

DW61_2和D12_1與“普通”細胞比較，GO富集與KEGG富集均無顯著趨勢，其差異表達基因的功能多為抑制蛋白活性和糖代謝、阻遏細胞生長。如D12_1中基因[47]的顯著下調會抑制結合蛋白mRNA的轉運，進而抑制細胞分裂；基因[48]的下調會影響高爾基體內部囊泡介導物質運輸，抑制高爾基體和微管間的相互作用，抑制細胞有絲分裂；在DW61_2中表達下調的基因中，基因[49]編碼二硫化物還原酶，其下調會抑制細胞生長，降低細胞活力；基因[50,51]在胚胎發(fā)生和傷口愈合過程中高度表達。該基因產物是一種基質細胞蛋白，能促進基質組裝，并能刺激內皮細胞的增殖和遷移，以及血管生成活性，其表達下調不利于胚胎發(fā)生和后續(xù)克隆動物的生長發(fā)育。因此，DW61_2、DW12_1的基因表達模式呈現抑制細胞活力，促進細胞凋亡的趨勢，同時根據已有研究證據無法將這兩個“另類”細胞與精英供體細胞相關聯，其基因表達模式并不具備代表性。

DW99_2與對照組相比，GO富集上調的差異表達基因主要和DNA復制、染色體分離、核酸代謝等生物過程相關，KEGG分析結果顯示顯著富集于DNA復制、細胞周期更迭等通路，基因組處于活躍狀態(tài)，明顯區(qū)別于其他供體細胞。在顯著表達上調基因中，基因和胚胎干細胞轉錄調控網絡相關，其轉錄因子P52951可作為胚胎多能性因子[52,53]，而多能性因子是影響克隆胚胎發(fā)育潛力的重要因素。基因是一種蛋白質編碼基因，其功能主要是調控外胚層分化，在細胞重編程中發(fā)揮關鍵作用[54,55]?；虻南嚓P途徑中有網格蛋白介導的內吞作用，值得注意的是，在小鼠克隆胚2細胞期停滯胚胎單細胞轉錄組測序研究中，也報道了與內吞作用相關的基因激活不足的現象[56]，說明與內吞途徑相關基因可能影響SCNT胚胎的發(fā)育效率。在體細胞重編程過程中，大量基因能否被成功激活直接影響克隆胚胎的發(fā)育命運。同時，已有研究表明供體細胞基因表達模式影響克隆效率[57]。因此，在供體細胞基因表達、核重編程、胚胎關鍵基因激活之間一定存在微妙的聯系。DW99_2活躍基因組狀態(tài)，可能有利細胞重編程，但是需要在不同情況下進行區(qū)分：先前關于SCNT胚胎重編程異常原因的報道主要集中于抑制性的表觀遺傳修飾[58,59]，表現為協調胚胎發(fā)育所需基因失敗，部分基因表達受到抑制，基因組不活躍。但是在克隆牛的研究中，供體細胞基因組的異常激活狀態(tài)會阻礙克隆胚胎發(fā)育[18]。在克隆小鼠中，供體細胞異常激活的基因卻會在胚胎發(fā)育中被成功重編程[60]，說明供體細胞的基因組狀態(tài)不完全決定SCNT胚胎的發(fā)育命運，不同物種之間是存在差異的，需要進一步研究豬供體細胞基因組狀態(tài)與克隆胚胎發(fā)育命運的聯系。

目前，關于供體細胞異質性對核移植胚胎發(fā)育效率的影響還有很多問題亟待解決。就研究廣泛性而言，類似研究鮮有報道，同時，供體細胞異質性受物種、遺傳變異、環(huán)境差異和物理刺激等多因素影響，需要更全面的研究來闡述造成這種差異的分子機制以及對核移植胚胎發(fā)育的影響。就研究深度而言，一方面需要有參考價值的精英供體細胞、克隆胚胎的遺傳信息，另一方面，需要建立一種體系或技術，輔助研究人員根據供體細胞的分子特征篩選潛在精英供體細胞，并進行核移植實驗來驗證。在未來，可利用豬克隆胚胎活檢技術(在2細胞、4細胞期對每個胚胎抽取一個卵裂球用于單細胞測序，每個胚胎剩余的部分繼續(xù)培養(yǎng)觀察其能否發(fā)育至囊胚，從而把抽取的卵裂球分成發(fā)育正常和異常兩組樣本)結合單細胞測序技術確定發(fā)育正常及異常的克隆胚胎的基因表達模式，通過分析本研究所獲得的4個“另類”供體細胞與發(fā)育正常的克隆胚胎的基因表達模式的關聯，從4個“另類”細胞中篩選出潛在的精英供體細胞，根據該精英供體細胞的基因表達特征設計可識別該精英供體細胞的探針或抗體，然后通過流式細胞儀分選等技術在供體細胞中篩選和富集精英供體細胞進行核移植，驗證利用該精英供體細胞制備的克隆胚胎的發(fā)育是否高于普通供體細胞。最近，Li等[56]利用單細胞測序技術，通過比較核移植2細胞期正常發(fā)育胚胎、停滯發(fā)育胚胎，4細胞期正常發(fā)育胚胎、停滯發(fā)育胚胎的轉錄組數據，找出影響小鼠克隆胚胎重編程的潛在通路和關鍵基因，為在細胞水平研究克隆胚胎異常發(fā)育的原因提供了參考。相信隨著單細胞測序技術的不斷成熟，該技術在克隆研究中的應用有望取得進一步突破：一方面，單細胞多組學聯合分析的發(fā)展有助于建立“基因組–轉錄組–代謝組–表型”的系統研究網路；另一方面，更多種類、更多數量的供體細胞命運將通過單細胞測序技術被追蹤，形成“供體細胞–2細胞–4細胞–8細胞–囊胚–移植后胚胎”的完整研究體系，描繪供體細胞核和卵母細胞質相互作用的動態(tài)過程，綜合分析影響克隆胚胎核移植效率的分子機制，進而提高克隆效率。

[1] Wilmut I, Schnieke AE, Mcwhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells., 1997, 385(6619): 810–813.

[2] Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, de León FAP, Robl JM. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts., 1998, 280(5367): 1256–1258.

[3] Onishi A, Iwamoto M, Akita T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry AC. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei., 2000, 289(5482): 1188–1190.

[4] Liu Z, Cai YJ, Wang Y, Nie YH, Zhang CC, Xu YT, Zhang XT, Lu Y, Wang ZY, Poo M, Sun Q. Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer., 2018, 172(4): 881–887.

[5] Beyhan Z, Iager AE, Cibelli JB. Interspecies nuclear transfer: implications for embryonic stem cell biology., 2007, 1(5): 502–512.

[6] Niemann H, Lucas-Hahn A. Somatic cell nuclear transfer cloning: practical applications and current legislation., 2012, 47(Suppl. 5): 2–10.

[7] Tachibana M, Amato P, Sparman M, Gutierrez N M, Tippner-Hedges R, Ma H, Kang E, Fulati A, Lee H S, Sritanaudomchai H, Masterson K, Larson J, Eaton D, Sadler-Fredd K, Battaglia D, Lee D, Wu D, Jensen J, Patton P, Gokhale S, Stouffer RL, Wolf D, Mitalipov S. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer., 2013, 153(6): 1228–1238.

[8] Ao Z, Wu X, Zhou J, Gu T, Wang XW, Shi JS, Zhao CF, Cai GY, Zheng EQ, Liu DW, Wu ZF, Li ZC. Cloned pig fetuses exhibit fatty acid deficiency from impaired placental transport., 2019, 86(11): 1569–1581.

[9] Liu Y, Li J, L?vendahl P, Schmidt M, Larsen K, Callesen H. In vitro manipulation techniques of porcine embryos: a meta-analysis related to transfers, pregnancies and piglets., 2015, 27(3): 429–439.

[10] Jang G, Park ES, Cho JK, Bhuiyan MM, Lee BC, Kang SK, Hwang WS. Preimplantational embryo development and incidence of blastomere apoptosis in bovine somatic cell nuclear transfer embryos reconstructed with long-term cultured donor cells., 2004, 62(3–4): 512–521.

[11] Zhang DF, Liu D, Tang LL, Wang Y, Chen Y, Wang K, Wang GL, Schellander K, Cailu L. Effects of different donor cells on the development of nuclear-trans-ferred porcine embryos., 2007, 29(2): 211–217.張德福, 劉東, 湯琳琳, 王英, 陳茵, 王凱, 王根林, KARL Schellander, LIN Cailu. 不同供體細胞及其處理對豬核移植重構胚體外發(fā)育的影響. 遺傳, 2007, 29(2): 211–217.

[12] Ruan ZY, Zhao X, Li ZD, Qin XL, Shao QM, Ruan QY, Deng YF, Jiang JR, Huang B, Lu FH, Shi DS. Effect of sex differences in donor foetal fibroblast on the early development and DNA methylation status of buffalo (Bubalus bubalis) nuclear transfer embryos., 2019, 54(1): 11–22.

[13] Rideout WR, Eggan K, Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome., 2001, 293(5532): 1093–1098.

[14] Yang XQ, Wu ZF, Li ZC. Advances in epigenetic reprogramming of somatic cells nuclear transfer in mam-mals., 2019, 41(12): 1099–1109.楊旭瓊, 吳珍芳, 李紫聰. 哺乳動物體細胞核移植表觀遺傳重編程研究進展. 遺傳, 2019, 41(12): 1099–1109.

[15] Zhai YH, Li W, Zhang ZR, Cao YQ, Wang ZZ, Zhang S, Li ZY. Epigenetic states of donor cells significantly affect the development of somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos in pigs., 2018, 85(1): 26–37.

[16] Yamanaka S. Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation., 2009, 460(7251): 49–52.

[17] Inoue K, Ogonuki N, Mochida K, Yamamoto Y, Takano K, Kohda T, Ishino F, Ogura A. Effects of donor cell type and genotype on the efficiency of mouse somatic cell cloning.,2003, 69(4): 1394–1400.

[18] Zhou C, Zhang JC, Zhang M, Wang DB, Ma Y, Wang Y, Wang YZ, Huang YM, Zhang Y. Transcriptional memory inherited from donor cells is a developmental defect of bovine cloned embryos., 2020, 34(1): 1637–1651.

[19] Picelli S, Faridani OR, Bj?rklund AK, Winberg G, Sagasser S, Sandberg R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2., 2014, 9(1): 171–181.

[20] Grubman A, Chew G, Ouyang JF, Sun GZ, Choo XY, Mclean C, Simmons RK, Buckberry S, Vargas-Landin DB, Poppe D, Pflueger J, Lister R, Rackham O, Petretto E, Polo JM. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type- specific gene expression regulation.,2019, 22(12): 2087–2097

[21] Tang FC, Barbacioru C, Wang YZ, Nordman E, Lee C, Xu NN, Wang XH, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A, Lao K, Surani MA. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell., 2009, 6(5): 377–382.

[22] Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements., 2015, 12(4): 357–360.

[23] Wang LK, Feng ZX, Wang X, Wang XW, Zhang XG. DEGseq: an R package for identifying differentially expressed genes from RNA-seq data., 2010, 26(1): 136–138.

[24] Young MD, Wakefield MJ, Smyth GK, Oshlack A. Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias., 2010, 11(2): R14.

[25] Robinson MD, Mccarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data., 2010, 26(1): 139–140.

[26] Navin N, Hicks J. Future medical applications of single-cell sequencing in cancer., 2011, 3(5): 31.

[27] Novick A, Weiner M. Enzyme induction as an all-or-none phenomenon., 1957, 43(7): 553–566.

[28] Coskun AF, Eser U, Islam S. Cellular identity at the single-cell level., 2016, 12(10): 2965–2979.

[29] Menon M, Mohammadi S, Davila-Velderrain J, Goods BA, Cadwell TD, Xing Y, Stemmer-Rachamimov A, Shalek AK, Love JC, Kellis M, Hafler BP. Single-cell transcriptomic atlas of the human retina identifies cell types associated with age-related macular degeneration.,2019, 10(1): 4902.

[30] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.,2007, 131(5): 861–872.

[31] Lowry WE, Richter L, Yachechko R, Pyle AD, Tchieu J, Sridharan R, Clark AT, Plath K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts., 2008, 105(8): 2883–2888.

[32] Polo JM, Liu S, Figueroa M E, Kulalert W, Eminli S, Tan KY, Apostolou E, Stadtfeld M, Li YS, Shioda T, Natesan S, Wagers AJ, Melnick A, Evans T, Hochedlinger K. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells., 2010, 28(8): 848–855.

[33] Lai L, Tao T, Macháty Z, Kühholzer B, Sun QY, Park KW, Day BN, Prather RS. Feasibility of producing porcine nuclear transfer embryos by using G2/M-stage fetal fibroblasts as donors.,2001, 65(5): 1558– 1564.

[34] Chesné P, Adenot PG, Viglietta C, Baratte M, Boulanger L, Renard JP. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells.,2002, 20(4): 366–369.

[35] Sutovsky P, Moreno RD, Ramalho-Santos J, Dominko T, Simerly C, Schatten G. Ubiquitin tag for sperm mitochondria.,1999, 402(6760): 371–372.

[36] Onishi A, Iwamoto M, Akita T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry AC. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei.,2000, 289(5482): 1188–1190.

[37] Gupta S, Sahu D, Bomalaski JS, Frank I, Boorjian SA, Thapa P, Cheville J C, Hansel DE. Argininosuccinate Synthetase-1 (ASS1) loss in high-grade neuroendocrine carcinomas of the urinary bladder: implications for targeted therapy with ADI-PEG 20., 2018, 29(3): 236–241.

[38] Moren L, Perryman R, Crook T, Langer JK, Oneill K, Syed N, Antti H. Metabolomic profiling identifies distinct phenotypes for ASS1 positive and negative GBM.,2018, 18(1): 167.

[39] Bang J, Lee E, Lee AR, Il Lee J, Choi SH, Seol D, Park C, Lee DR. The effect of cell penetrating peptide-conjugated coactivator-associated arginine methyltransferase 1 (CPP-CARM1) on the cloned mouse embryonic development.,2018, 8(1): 16721.

[40] Abdel-Hady AE, Beige J, Kreutz R, Bolbrinker J. Effect of UMOD genotype on long-term graft survival after kidney transplantation in patients treated with cyclosporine-based therapy.,2018, 18(2): 227–231.

[41] Bailie C, Kilner J, Maxwell AP, Mcknight AJ. Development of next generation sequencing panel for UMOD and association with kidney disease.,2017, 12(6): e0178321.

[42] Davis D, Kannan M, Wattenberg B. Orm/ORMDL proteins: Gate guardians and master regulators.,2018, 70: 3–18.

[43] Fava RA, Browning JL, Gatumu M, Skarstein K, Bolstad AI. LTBR-pathway in Sjogren's syndrome: CXCL13 levels and B-cell-enriched ectopic lymphoid aggregates in NOD mouse lacrimal glands are dependent on LTBR., 2011, 691: 383–390.

[44] Zhu QQ, Li N, Li F, Sang J, Deng H, Han QY, Lv Y, Li CY, Liu ZW. Association of LTBR polymorphisms with chronic hepatitis B virus infection and hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma., 2017, 49: 126–131.

[45] Sia D, Losic B, Moeini A, Cabellos L, Hao K, Revill K, Bonal D, Miltiadous O, Zhang ZY, Hoshida Y, Cornella H, Castillo-Martin M, Pinyol R, Kasai Y, Roayaie S, Thung S N, Fuster J, Schwartz ME, Waxman S, Cordon-Cardo C, Schadt E, Mazzaferro V, Llovet JM. Massive parallel sequencing uncovers actionable FGFR2-PPHLN1 fusion and ARAF mutations in intrahepatic cholangiocarcinoma.,2015, 6: 6087.

[46] Chung YG, Matoba S, Liu YT, Eum JH, Lu FL, Jiang W, Lee JE, Sepilian V, Cha KY, Lee DR, Zhang Y. Histone demethylase expression enhances human somatic cell nuclear transfer efficiency and promotes derivation of pluripotent stem cells., 2015, 17(6): 758–766.

[47] Boone PM, Yuan B, Gu S, Ma ZW, Gambin T, Gonzaga-Jauregui C, Jain M, Murdock TJ, White JJ, Jhangiani SN, Walker K, Wang QY, Muzny DM, Gibbs RA, Hejtmancik JF, Lupski JR, Posey JE, Lewis RA. Hutterite-type cataract maps to chromosome 6p21.32- p21.31, cosegregates with a homozygous mutation in LEMD2, and is associated with sudden cardiac death., 2016, 4(1): 77–94.

[48] Mcgee LJ, Jiang AL, Lan Y. Golga5 is dispensable for mouse embryonic development and postnatal survival., 2017, 55(7): 10.1002/dvg.23039.

[49] O'Grady GL, Best HA, Sztal TE, Schartner V, Sanjuan-Vazquez M, Donkervoort S, Abath NO, Sutton RB, Ilkovski B, Romero NB, Stojkovic T, Dastgir J, Waddell L B, Boland A, Hu Y, Williams C, Ruparelia AA, Maisonobe T, Peduto AJ, Reddel SW, Lek M, Tukiainen T, Cummings BB, Joshi H, Nectoux J, Brammah S, Deleuze JF, Ing VO, Ramm G, Ardicli D, Nowak KJ, Talim B, Topaloglu H, Laing NG, North K N, Macarthur DG, Friant S, Clarke NF, Bryson-Richardson RJ, B?nnemann CG, Laporte J, Cooper ST. Variants in the oxidoreductase PYROXD1 cause early-onset myopathy with internalized nuclei and myofibrillar disorganization.,2016, 99(5): 1086–1105.

[50] Al-Dabbagh N, Al-Shahrani H, Al-Dohayan N, Mustafa M, Arfin M, Al-Asmari AK. The SPARC-related modular calcium binding protein 2 (SMOC2) gene polymorphism in primary glaucoma: a case-control study., 2017, 11: 549–555.

[51] Huang XQ, Zhou ZQ, Zhang XF, Chen CL, Tang Y, Zhu Q, Zhang JH, Xia JC. Overexpression of SMOC2 attenuates the tumorigenicity of hepatocellular carcinoma cells and is associated with a positive postoperative prognosis in human hepatocellular carcinoma.,2017, 8(18): 3812–3827.

[52] Hagan N, Guarente J, Ellisor D, Zervas M. The temporal contribution of the Gbx2 lineage to cerebellar neurons., 2017, 11: 50.

[53] Mallika C, Guo QX, Li JYH. Gbx2 is essential for maintaining thalamic neuron identity and repressing habenular characters in the developing thalamus., 2015, 407(1): 26–39.

[54] Alber M, Kalscheuer VM, Marco E, Sherr E, Lesca G, Till M, Gradek G, Wiesener A, Korenke C, Mercier S, Becker F, Yamamoto T, Scherer SW, Marshall CR, Walker S, Dutta UR, Dalal A B, Suckow V, Jamali P, Kahrizi K, Najmabadi H, Minassian BA. ARHGEF9 disease: Phenotype clarification and genotype-phenotype correlation., 2017, 3(3): e148.

[55] Klein KM, Pendziwiat M, Eilam A, Gilad R, Blatt I, Rosenow F, Kanaan M, Helbig I, Afawi Z. The phenotypic spectrum of ARHGEF9 includes intellectual disability, focal epilepsy and febrile seizures.,2017, 264(7): 1421–1425.

[56] Li HS, Song MM, Yang W, Cao P, Zheng L, Zuo YC. A Comparative analysis of single-cell transcriptome identifies reprogramming driver factors for efficiency improvement., 2020, 19: 1053–1064.

[57] Inoue K, Ogonuki N, Mochida K, Yamamoto Y, Takano K, Kohda T, Ishino F, Ogura A. Effects of donor cell type and genotype on the efficiency of mouse somatic cell cloning., 2003, 69(4): 1394–1400.

[58] Xie BT, Zhang H, Wei RY, Li QN, Weng XG, Kong QR, Liu ZH. Histone H3 lysine 27 trimethylation acts as an epigenetic barrier in porcine nuclear reprogramming., 2016, 151(1): 9–16.

[59] Matoba S, Liu YT, Lu FL, Iwabuchi KA, Shen L, Inoue A, Zhang Y. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation., 2014, 159(4): 884–895.

[60] Liu Y, Wu FR, Zhang L, Wu XQ, Li DK, Xin J, Xie J, Kong F, Wang WY, Wu QQ, Zhang D, Wang R, Gao SR, Li WY. Transcriptional defects and reprogramming barriers in somatic cell nuclear reprogramming as revealed by single-embryo RNA sequencing., 2018, 19(1): 734.

Transcriptome heterogeneity of porcine ear fibroblast and its potential influence on embryo development in nuclear transplantation

Jun Zhou1, Chengcheng Zhao1, Xiao Wu1, Junsong Shi2, Rong Zhou2, Zhenfang Wu1, Zicong Li1

There is heterogeneity among donor cells of the same source.Many studies have shown that donor cell affects the efficiency of somatic cell nuclear transfer (SCNT).However, the potential influence of donor cell heterogeneity on the efficiency of nuclear transplantation were rarely analyzed at the single-cell level.In this study, single-cell transcriptome sequencing was performed on 52 porcine ear fibroblasts randomly selected from the same source to compare their gene expression patterns. The results showed that 48 cells had similar gene expression patterns, whereas 4 cells (D11_1, D12_1, DW61_2, DW99_2) had significantly different gene expression patterns from those of other cells. There were no two cells with identical gene expression patterns. The gene expression patterns of D11_1, D12_1, DW61_2 and DW99_2 were analyzed, using the 48 cells with similar gene expression patterns as controls. Firstly, we used the R language statistics to select the differentially expressed genes in the 4 single cells, and identified the top 50 most significant differentially expressed genes. Then GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis were performed on the differentially expressed genes. Enrichment analysis revealed that the main molecular functions of the differentially expressed genes included energy metabolism, protein metabolism and cell response to stimulation. The main pathways from KEGG enrichment were related to cell cycle, cell metabolism, and DNA replication. Finally, based on the above results and in consideration with the SCNT research progress, we discussed the potential effects of differential gene expression patterns of the 4 single cells on the embryonic development efficiency of nuclear transplantation. This study revealed transcriptional heterogeneity of porcine ear tissue fibroblasts and provided an effective method to analyze elite donor cells, thereby providing new ideas on improving the cloning efficiency of SCNT.

pigs; SCNT; donor cell; heterogeneity; single-cell sequencing

2020-06-22;

2020-08-11

廣東省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項(2018年)資助[Supported by Guangdong Provincial Promotion Project on Preservation and Utilization of Local Breed of Livestock and Poultry (2018)]

周俊，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: 374949357@qq.com

李紫聰，教授，博士生導師，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: lizicongcong@163.com

10.16288/j.yczz.20-190

2020/9/2 16:08:53

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200831.1604.002.html

(責任編委: 趙要風)