管飄萍 Enkhbayar Munkhbayar 黃紫貝 黎順庚 嵇靜慧 陳詩(shī)涵 王海燕 劉文博 卞建春

摘要：我國(guó)茶葉特別是發(fā)酵茶葉中含有許多有益真菌，其代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗癌、降脂、降壓的功能。目前，關(guān)于茶葉中真菌功能的研究很多，但在畜牧業(yè)中尚無(wú)相關(guān)應(yīng)用研究。取湖南安化金花茯磚茶、天福南糯山熟餅、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁門(mén)紅茶和金茯茶共8種茶葉進(jìn)行真菌分離、純化，共得到23株菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS基因序列的鑒定，共得到擬莖點(diǎn)霉菌1株，變色栓菌1株，枝狀枝孢菌1株，黑曲霉2株，曲霉菌1株，冠突曲霉2株，阿姆斯特丹曲霉6株，棕曲霉2株，格孢菌1株，擴(kuò)展青霉菌1株，擬盤(pán)多毛孢菌1株，球孢枝孢菌2株，變色曲霉2株。結(jié)果為這些真菌的進(jìn)一步研究和在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。并且將其中的優(yōu)勢(shì)菌屬冠突散囊菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，為后期的生產(chǎn)實(shí)踐做好準(zhǔn)備。

關(guān)鍵詞：茶葉;真菌;分離;鑒定;冠突散囊菌;阿姆斯特丹曲霉

中圖分類號(hào)：TS272.7;S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）16-0285-06

茶葉種類繁多，不同國(guó)家的茶葉分類方法各有不同。我國(guó)根據(jù)出口茶類別，將茶葉一共分為7類，分別是綠茶、紅茶、黃茶、黑茶、白茶、青茶。祁門(mén)紅茶屬于紅茶，茯磚茶、普洱茶和天福南糯山熟餅屬于黑茶，天福白茶屬于白茶。

我國(guó)多種茶中存在有益的真菌，尤其是渥堆發(fā)酵的茶葉，其代謝產(chǎn)物具有降血脂[1-3]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[4-6]、抗菌以及抗氧化[7]等多種功能，冠突散囊菌就是其中之一，它是茯磚茶中的主要優(yōu)勢(shì)菌種，是茯磚茶后段發(fā)酵的益生菌，可在茶葉上形成菌苔，呈金黃色，俗稱“金花”。冠突散囊菌能夠在高溫下存活并能產(chǎn)生各種胞外酶，能有效地催化茶葉中多酚、氨基酸和多糖等成分發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化[8]。溫瓊英證實(shí)了冠突散囊菌能分解茶中單寧物質(zhì)和淀粉，減少茶葉的苦澀口感，使茶味香醇[9]。黃群等的研究表明，冠突散囊菌有助于人體消化吸收淀粉和蛋白質(zhì)[10]。目前這些研究主要集中于茶葉學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而在畜牧學(xué)方面的應(yīng)用研究很少。本試驗(yàn)于2019年在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行，擬從茶葉中分離出有益的真菌，研究其代謝產(chǎn)物和過(guò)程，并將其應(yīng)用于畜牧學(xué)領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉來(lái)源 試驗(yàn)所用的茶葉均通過(guò)網(wǎng)購(gòu)或者在茶葉店購(gòu)買(mǎi)獲得，有湖南安化金花茯磚茶（2007）、天福南糯山熟餅、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱茶、祁門(mén)紅茶和湖南安化金茯茶（2014）共8種茶葉。

1.1.2 主要器材 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），Mini Plus小型離心機(jī)（Eppendorf 公司），PCR儀[愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司]，DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），冰箱，恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫金屬浴（上海比朗儀器有限公司）等。

1.1.3 主要試劑和培養(yǎng)基 80萬(wàn)U/支注射用青霉素鈉、100萬(wàn)U/支注射用硫酸鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）;Fungi Identification PCR Kit試劑盒[寶生物工程（大連）公司];TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒、Super GelRedTM 10 000×（蘇州宇恒生物科技有限公司）;馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）;D（+）-無(wú)水葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;馬鈴薯浸粉（青島日水生物技術(shù)有限公司）;Trypton、Yeast Extract（Thermo Fisher Scientific公司），Agar（南京百斯凱科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 真菌培養(yǎng)

1.2.1.1 培養(yǎng)基的配制 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉39 g，加超純水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌15 min;改良LB培養(yǎng)基：Tpyptone 4 g，Yeast Extract 4 g，葡萄糖16 g，瓊脂粉6 g， 121 ℃ 高壓滅菌15 min。

1.2.1.2 茶葉樣本的處理 取購(gòu)得的湖南安化金花茯磚茶（2007）、天福南糯山熟餅、天福茗茶、天福白茶、安吉普洱茶、天福普洱、祁門(mén)紅茶和湖南安化金茯茶（2014），各5 g于15 mL離心管中，標(biāo)記為 1～8，備用。用超純水溶解青霉素鈉和硫酸鏈霉素至終濃度分別為50 μg/mL和100 μg/mL，取 5.5 mL 加入上述8個(gè)離心管中，常溫孵育3 h。

1.2.1.3 真菌的培養(yǎng) 取200 μL上清液分別接種涂布于PDA固體平板和改良LB平板上，28 ℃，保濕培養(yǎng)。

1.2.2 真菌純化 蘸取分離培養(yǎng)得到的每種真菌的單個(gè)菌落，接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，分別純化培養(yǎng)，共分離純化培養(yǎng)3次，直至形成單個(gè)菌落。

1.2.3 真菌鑒定

1.2.3.1 真菌DNA提取 取純化培養(yǎng)3次后的真菌，每個(gè)樣都取火柴頭大小，放入滅菌的1.5 mL離心管中，加入1 mL高壓滅菌后的磷酸緩沖鹽（PBS）溶液，充分振蕩混勻，加入直徑為0.5 mm的磁珠，用振蕩儀振蕩研磨 3 min 后，觀察樣本是否被充分研磨。如果仍然有大塊的樣本未被研磨破碎，則采取水煮裂解法，裂解10 min后，再次用振蕩儀研磨，直至樣本被研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)的大的團(tuán)塊。以 12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 2 min，取上清液置于滅菌后的1 mL離心管中標(biāo)號(hào)，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增 試驗(yàn)所需的真菌基因組DNA可通過(guò)試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit 提取，提取產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

用于ITS序列擴(kuò)增的反應(yīng)體系見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸 5 min。將獲得的陽(yáng)性樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用Seq Forward Primer和Seq Reverse Primer進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序引物序列為Seq Reverse Primer：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′;Seq Forward Primer：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′。

1.2.4 冠突散囊菌的擴(kuò)大培養(yǎng)

1.2.4.1 液體培養(yǎng)基配制 PDA液體培養(yǎng)基：取49 g馬鈴薯浸粉，溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用;馬鈴薯安化茶湯培養(yǎng)基：將洗干凈的馬鈴薯去皮切塊，稱取200 g，加水煮沸 30 min，用紗布過(guò)濾，取濾液，加葡萄糖20 g，用去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

1.2.4.2 擴(kuò)大培養(yǎng) 將純化好的冠突散囊菌分別接種于裝有300 mL PDA液體培養(yǎng)基和馬鈴薯安化茶湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃下保濕培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離菌株純化后的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1和表2。

2.2 真菌分子鑒定結(jié)果

23株分離株DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

測(cè)出序列后，將所得基因序列用EditSeq生物軟件正確打開(kāi)后，進(jìn)入NCBI網(wǎng)站主頁(yè)，選擇BLAST中的Nucleotide BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析，再結(jié)合表型特征確定分離到的真菌的種類。其中，由于第6種茶葉天福普洱茶中未分離出真菌，因此沒(méi)有測(cè)序結(jié)果。將獲得的基因序列提交至GenBank上，得序列號(hào)MH395152～MH395172和MH424452～MH424453（表3）。

2.3 冠突散囊菌擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果

靜置培養(yǎng)5 d后，2種培養(yǎng)基中均出現(xiàn)菌落（圖4、圖5），但是馬鈴薯安化茶湯液體培養(yǎng)基中的菌落比PDA液體培養(yǎng)基中的菌落長(zhǎng)得更快更多，能形成菌苔。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中茶葉真菌首先采用改良LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基一起培養(yǎng)，純化時(shí)均采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)試驗(yàn)，所有菌株都生長(zhǎng)良好。同一種茶葉中分離培養(yǎng)所得菌株，經(jīng)分子學(xué)鑒定后為同一種真菌的形態(tài)也有所不同，如2-3和2-4以及3-2、3-3和3-4，它們?yōu)橥环N真菌，但在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不一致，因此用形態(tài)學(xué)方法很難進(jìn)行具體區(qū)分，具體的鑒定還需要用分子生物學(xué)的方法。

在分離到的23種真菌中，主要的優(yōu)勢(shì)菌屬為黑曲霉、冠突曲霉菌、阿姆斯特丹曲霉、棕曲霉和變色曲霉。在天福南糯山熟餅和天福茗茶中都分離到了黑曲霉;在天福茗茶和湖南安化金茯茶（2014）中都分離到了阿姆斯特丹曲霉;在天福白茶和祁門(mén)紅茶中都分離到了棕曲霉，由于以上3種真菌都是曲霉菌屬，可以得出，本試驗(yàn)的大優(yōu)勢(shì)菌屬就是曲霉菌屬。接下來(lái)將對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的代謝產(chǎn)物和代謝過(guò)程進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)其抑菌和抗癌作用，為其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。枝孢屬真菌是植物病原菌，分布廣泛，可以從土壤、空氣及各種有機(jī)質(zhì)中分離得到。本試驗(yàn)在湖南安化金花茯磚茶（2007）、祁門(mén)紅茶中均有分離到枝孢屬真菌，普洱茶發(fā)酵和貯藏中也發(fā)現(xiàn)有枝孢屬真菌[11]，目前對(duì)枝孢屬真菌的研究較少，有待進(jìn)一步研究。擬莖點(diǎn)霉屬真菌既是重要的植物病原，可引起多種病害，又是植物的一種內(nèi)生真菌，可與植物相互作用，目前已作為致病菌在多種植物中分離到[12-13]，本試驗(yàn)在湖南安化金花茯磚茶（2007）和安吉普洱中也有發(fā)現(xiàn)，表明茶葉在生產(chǎn)過(guò)程中并未能完全抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，且有這類真菌的茶葉中冠突散囊菌等優(yōu)勢(shì)真菌明顯較少，這些病原菌是否對(duì)茶葉的制作過(guò)程以及是否具有潛在毒性還需進(jìn)一步研究。

冠突散囊菌作為茶葉中的優(yōu)勢(shì)菌屬，且有降脂、抗菌、抗氧化等多種功能，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯安化茶湯液體培養(yǎng)基更適合冠突散囊菌的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度明顯高于成品的PDA液體培養(yǎng)基，這可能是由于茶湯中含有更適于冠突散囊菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)此進(jìn)一步研究可以優(yōu)化冠突散囊菌的培養(yǎng)條件。

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