池偉偉，牛英豪，董麗萍，張繼華，武廣麗，宋冬梅*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床生物樣本庫，河北 石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 石家莊 050031)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)是臨床常見的睡眠類疾病，其發(fā)病率逐年增高[1-3]。眾多研究也已證實(shí)，OSAHS是心腦血管疾病的源頭性疾病，是心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立風(fēng)險因素[4-5]，對人類健康造成嚴(yán)重危害。因此，探明其疾病進(jìn)程的分子機(jī)制，制定出有效治療方案是這一領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。數(shù)量眾多的臨床證據(jù)顯示，OSAHS患者血管功能受到損傷，內(nèi)皮功能如內(nèi)皮依賴性血管舒張功能失調(diào)，由此可能造成OSAHS并發(fā)癥如糖尿病微血管病變及高血壓等心腦血管病變，最終引起動脈粥樣硬化形成的始動原因[6]。因此，血管內(nèi)皮損傷機(jī)制是現(xiàn)階段OSAHS研究的主要熱點(diǎn)，但是，與OSAHS相關(guān)的血管內(nèi)皮修復(fù)機(jī)制關(guān)注較少。最近在心血管疾病的領(lǐng)域的研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在可以修復(fù)損傷的血管，在修復(fù)血管的損傷的過程中具有重要意義[7-9]，EPCs是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管形成以及血管內(nèi)皮損傷修復(fù)中起顯著作用，其中EPCs的數(shù)量與功能又是決定內(nèi)皮再生和血管修復(fù)的關(guān)鍵因素[10-12]。因此，探明OSAHS過程中，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與功能的變化，有助于進(jìn)一步明確OSAHS發(fā)生、發(fā)展及其介導(dǎo)并發(fā)癥的發(fā)病原因，才有可能制定有效的針對性防治策略。因此，本研究通過評估OSAHS患者和正常人群EPCs的數(shù)量和增殖、遷移及黏附能力，旨在明確OSAHS患者EPCs數(shù)量和功能的變化規(guī)律，為OSAHS疾病及其導(dǎo)致的并發(fā)癥的預(yù)防與治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性研究2016年11月—2018年7月收錄于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床樣本庫經(jīng)耳鼻咽喉科確診為OSAHS并住院治療的成人患者30例為OSAHS組，男性18例，女性12例，年齡24～67歲，平均(43.6±10.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：PSG監(jiān)測每晚7 h睡眠過程中呼吸暫停和低通氣反復(fù)發(fā)作>30次或睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(apnea hypopnea index,AHI)≥5次/h者，且呼吸暫停和低通氣以阻塞性為主，參考依據(jù)《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)》[13]具體標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：①就診前或住院期間發(fā)現(xiàn)患有慢性阻塞性肺疾病、肺動脈高壓、支氣管哮喘等肺部疾病者；② 3個月內(nèi)有心絞痛、心肌梗死發(fā)作病史者；③ 就診時患有嚴(yán)重中樞性疾病及精神疾病者；④ 患有甲狀腺功能減退癥、慢性腎功能衰竭者；⑤ 就診前或住院期間發(fā)現(xiàn)患有惡性腫瘤疾病或自身免疫性疾病者；⑥ 患有胸廓畸形或神經(jīng)肌肉性疾病者；⑦ 近期曾服用或正在服用影響睡眠呼吸類藥物者；⑧ 近期患有上呼吸道感染者；⑨ 既往急慢性肝炎或其他肝臟疾病者；⑩全身性激素替代療法史或肢端肥大癥者。同時選取河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院進(jìn)行體檢的人員中選擇年齡匹配的、自愿接受免費(fèi)的多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(polysomnography,PSG)檢查后排除OSAHS者30例為對照組，男性16例，女性14例，年齡28～65歲，平均(42.8±11.2)歲。2組性別、年齡等一般資料無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，入組人員均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、鑒定與培養(yǎng) 無菌采集參與者(空腹12 h，靜坐10 min)新鮮靜脈全血10 mL至肝素抗凝 (10 U/mL) 離心管。密度梯度離心法收集單核細(xì)胞，接種至預(yù)先包被人纖維連接蛋白的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(endothelial cell growth medium-2,EGM-2)培養(yǎng)4 d，非貼壁細(xì)胞予以磷酸鹽緩沖液除去，培養(yǎng)液更換至1周。收集細(xì)胞，在其中加入acLDL-Dil和FITC-UEA-1抗體，常溫孵育1 h，染色，完成后用熒光顯微鏡拍照，acLDL-Dil及FITC-UEA-1雙標(biāo)記者為EPCs。

1.2.2測定2組人群EPCs的數(shù)量 采用菌落形成法，使用濃度為20 mg/L人纖維連接蛋白預(yù)孵育六孔板，調(diào)整單核細(xì)胞的密度為5×109個進(jìn)行接種，繼續(xù)孵育2 d后收集非黏附細(xì)胞，調(diào)整密度為1×109細(xì)胞/孔，接種至鋪有人纖維連接蛋白的24孔板中，連續(xù)培養(yǎng)5 d，觀察集落形成并計數(shù)，評價兩組EPCs的數(shù)量。

1.2.3測定2組EPCs的增殖能力 貼壁細(xì)胞收集消化，用人纖維連接蛋白包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種相同數(shù)目的內(nèi)皮祖細(xì)胞，每個標(biāo)本設(shè)置3個空白對照復(fù)孔，在5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h，將20 μL二苯基四氮唑溴鹽(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)液體加入每孔內(nèi)，培養(yǎng)4 h，去除上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，混勻，在490 nm波長的酶標(biāo)儀下檢測吸光度，評價2組EPCs的增殖能力。

1.2.4測定2組EPCs的遷移能力 貼壁細(xì)胞收集消化，Boyden小室的下室加入EGM-2培養(yǎng)基，向上室注入2×105個內(nèi)皮祖細(xì)胞，在5%二氧化碳溫箱內(nèi)、37 ℃培養(yǎng)24 h；將濾膜上的未移動細(xì)胞刮去，甲醇固定，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色10 min，顯微鏡下觀察向低層遷移的細(xì)胞，評價2組EPCs的遷移能力。

1.2.5測定2組EPCs的黏附能力 貼壁細(xì)胞收集消化，用人纖維連接蛋白包被24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種相同數(shù)目的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)0.5 h，用PBS洗去未貼壁的細(xì)胞，評價兩組EPCs的黏附能力。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料比較 OSAHS組BMI為(28.400±4.857)，明顯高于對照組(25.100±3.650)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.587，P<0.05)；OSAHS組AHI為(35.900±11.015)，明顯高于對照組(2.600±1.016)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.440，P<0.01)。

2.2OSAHS患者外周血EPCs數(shù)量評估 OSAHS組外周血EPCs數(shù)量為(23.490±5.69)個，明顯低于對照組(33.150±9.85)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.395，P<0.01)，見圖1。

圖1 2組人群外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量結(jié)果

2.3OSAHS患者外周血EPCs增殖能力評估 OSAHS組吸光度為(0.350±0.019)，明顯低于對照組(0.920±0.038)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=70.260，P<0.01)。

2.4OSAHS患者外周血EPCs遷移能力評估 OSAHS組外周血EPCs遷移數(shù)為(14.590±7.256)個，明顯低于對照組(26.460±5.987)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.063，P<0.01)。

2.5OSAHS患者外周血EPCs黏附能力評估 OSAHS組外周血EPCs黏附率為(17.680±4.397)%，明顯低于對照組(23.280±3.857)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=30.790，P<0.01)。

3 討 論

EPCs是一種前體細(xì)胞，可以直接分化形成血管內(nèi)皮細(xì)胞，它的作用涉及血管形成、血管內(nèi)皮損傷、血管內(nèi)皮修復(fù)等方面，具有重要顯著作用。當(dāng)前的研究表明EPCs作用機(jī)制有兩個方面，一在促進(jìn)新心血管形成方面：通過EPCs本身的分化、增殖而形成新生血管，從而無需本來的血管系統(tǒng)為依靠；二在內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)方面：EPCs本身可以通過旁分泌效應(yīng)分泌血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞生長因子，從而促進(jìn)局部血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在心腦血管疾病的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高血壓、高血脂、高血糖以及相關(guān)血流動力學(xué)改變可降低骨髓活化進(jìn)入外周血EPCs的數(shù)量，并使EPCs修復(fù)功能下降，同時還可導(dǎo)致EPCs早衰和凋亡[14-17]，使其無法對有功能缺陷的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行及時修復(fù)，這是內(nèi)皮功能受損后無法及時修復(fù)的主要原因；同時研究人員發(fā)現(xiàn)這些骨髓來源的EPCs通過骨髓動員、歸巢，在損傷部位分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞并分泌促進(jìn)血管生成的相關(guān)因子，對心肌梗死以及缺血性休克具有潛在的治療效果[18-19]，因此EPCs在血管內(nèi)皮損傷及修復(fù)中的地位和作用也日益得到了廣泛的關(guān)注。

在OSAHS研究領(lǐng)域，盡管已知OSAHS患者的血管內(nèi)皮功能受損可能是導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成的起始誘因[5]，但是涉及OSAHS相關(guān)血管內(nèi)皮修復(fù)問題，尤其是EPCS介導(dǎo)的內(nèi)皮修復(fù)問題的研究較少；OSAHS患者EPCs數(shù)量、功能的變化規(guī)律還不清晰、研究尚處于初始階段，初步臨床研究結(jié)果也存在不一致之處，例如Jelic 等[20]研究顯示，無心腦血管相關(guān)疾病的成年OSAS患者其外周血EPCs數(shù)量減低，血流介導(dǎo)的血管舒張功能下降，但是也有報道并不認(rèn)同這一結(jié)論，Carreras 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠OSAS動物模型中外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)目明顯增多，為了明確EPCs數(shù)量和功能在OSAHS患者體內(nèi)的變化規(guī)律，本研究評估了正常對照組和OSAHS患者2組人群EPCs數(shù)量和功能，結(jié)果顯示，OSAHS患者體內(nèi)EPCs的數(shù)量明顯低于健康對照組，與Jelic等[20]研究結(jié)果相符；OSAHS患者體內(nèi)EPCs數(shù)量減少的原因，可能是OSAHS患者體內(nèi)的慢性間斷性缺氧狀態(tài)，影響了PI3K/AKT/eNOS等EPCs相關(guān)信號通路，導(dǎo)致EPCs功能障礙繼而造成了EPCS的數(shù)量減少。同時，EPCs可以定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到修復(fù)血管內(nèi)皮損傷的目的，是保持血管完整性的最重要的機(jī)制之一。然而，當(dāng)血液中EPCs的數(shù)量減少時會影響其修復(fù)功能。外周血EPCs的增殖能力、黏附能力、遷移能力決定其是否可到達(dá)受損部位，本研究的結(jié)果顯示，OSAHS患者體內(nèi)EPCs的增殖細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)及黏附細(xì)胞數(shù)較對照組均降低，提示OSAHS患者血管修復(fù)能力已受到損傷。

綜上所述，OSAHS可以導(dǎo)致外周血中EPCs數(shù)量減少并使其增殖能力、黏附能力及遷移能力受到損傷，繼而影響血管內(nèi)皮的功能，這可能是OSAHS引起動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要途徑。除直接損傷血管外，影響血管內(nèi)皮修復(fù)機(jī)制，減弱EPCs的數(shù)量、減退內(nèi)皮祖細(xì)胞功能，可能也是OSAHS而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙的原因。