紀 鵬，王偉隆，戴 穎，蔣 剛，黃旭雄,2,3

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海201306；2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海201306)

微藻種類繁多、分布廣泛，是水域生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者。與傳統(tǒng)農(nóng)作物相比，微藻具有光合效率和表面積生產(chǎn)力高，營養(yǎng)需求簡單，占用土地面積少等優(yōu)勢。微藻在固定CO2、凈化廢水、調(diào)節(jié)水質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。微藻中含有豐富的色素、脂質(zhì)、碳水化合物和脂肪酸等營養(yǎng)成分，可作為各種增值產(chǎn)品的原料，如生物柴油、顏料、生物醫(yī)藥和營養(yǎng)品等[1-2]。

微藻的生長率和生物量生產(chǎn)力通常取決于它們指數(shù)期內(nèi)將生物量翻倍的能力[3]。藻類的生長受多種環(huán)境因子的影響[4-5]，如溫度、鹽度、光照、pH等，其中光照是促進微藻細胞生長及其代謝活性的首要因素[6-8]，是微藻將CO2轉(zhuǎn)化為有機物質(zhì)的必要能源，不僅影響微藻的光合速率和產(chǎn)量，而且影響藻細胞的生物化學(xué)組分，許多研究表明光照對色素、脂質(zhì)和碳水化合物等細胞組分含量有所影響[9-10]。在藻類的長期進化中，不同種類的微藻對光照的適應(yīng)存在差異，因此，適宜的光照度對微藻的生長和目標產(chǎn)物的積累都至關(guān)重要。

綠球藻(Chlorococcumsp.)能夠利用有機碳源進行兼養(yǎng)培養(yǎng)，具有耐高溫[11]和高氨氮[12]的特性，在養(yǎng)殖廢水凈化處理和水產(chǎn)動物養(yǎng)殖方面具有很大的開發(fā)價值和前景，關(guān)于綠球藻生長所需的溫度、碳源和營養(yǎng)方式等影響因子已經(jīng)做了研究，但其對于光照度的需求還未有過探究。本研究分別在不同的光照度下對綠球藻進行兼養(yǎng)培養(yǎng)，測定并分析了光照度對綠球藻生長、色素、脂質(zhì)、碳水化合物和脂肪酸的影響，為綠球藻的大規(guī)模培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

實驗用綠球藻來自上海海洋大學(xué)生物餌料培養(yǎng)實驗室。取處于對數(shù)生長期的綠球藻藻液，經(jīng)3 000 r/min離心收集藻細胞，然后接種到1 L的滅菌三角燒瓶中，初始密度為5×106cells/mL，實驗共設(shè)計6個光照度，分別為0、1 500、3 000、4 500、6 000、7 500 lux，每個梯度3個平行，共18個樣品，實驗所用培養(yǎng)基為改良f/2培養(yǎng)基，主要成分為(mg/L)：C6H12O6500，NaNO3150，NaH2PO48.8，ZnSO4·4H2O·46，CuSO4·5H2O 20，MnCl2·4H2O 356，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 7800，NaMoO4·2H2O 14.6，Na2EDTA 8700，CoCl2·6H2O 24。實驗在光照培養(yǎng)箱中進行，培養(yǎng)溫度(35±1)℃，光周期12L ∶12D，每天定時搖藻4次，培養(yǎng)7 d。

1.3 測定指標和方法

1.3.1 綠球藻細胞密度、特定生長率和生物量的測定

實驗期間，每天采用XB-K-25血球計數(shù)板測定綠球藻細胞密度，每個樣品測定3次，并計算綠球藻的特定生長率K。實驗結(jié)束后，將100 mL藻液通過微孔濾膜(孔徑0.45 μm)抽濾，之后將濾膜置于85 ℃烘箱中烘干至恒重，并計算生物量(B)。

K=(lnNt-lnN0)/t

(1)

B(g/L)=(W1-W0)/V

(2)

式中，N0：初始藻細胞密度(cells/mL)；Nt：經(jīng)過時間t后藻細胞密度(cells/mL)；t：培養(yǎng)時間(d)；W0：微孔濾膜的質(zhì)量(g)；W1：含有藻液的微孔濾膜的質(zhì)量(g)；V：測定生物量所需藻液體積(L)。

1.3.2 綠球藻營養(yǎng)成分含量的測定

實驗結(jié)束后，取一定體積的藻液，離心后用去離子水清洗三次，獲取藻泥，并用甲醇提取綠球藻色素，采用分光光度計法[13-14]測定色素含量，根據(jù)以下公式計算葉綠素a(Pa)、葉綠素b(Pb)、類胡蘿卜素(Pc)含量，最后，根據(jù)藻細胞密度和生物量換算成百分含量。

Pa(μg/106cells)=(-8.096 2×A652+16.516 9×A665)×V1/V2/細胞密度×106

(3)

Pb(μg/106cells)=(27.440 5×A652-12.168 8×A665)×V1/V2/細胞密度×106

(4)

Pc(μg/106cells)=4×A480×V1/V2/細胞密度×106

(5)

式中，A480、A652、A665分別是在波長為480、652、665 nm下測定的吸光度；V1：甲醇體積(mL)；V2：測定藻液體積(mL)。

之后，將剩余藻液離心，并用去離子水反復(fù)清洗3次，將獲得的藻泥置于-40 ℃下冷凍干燥，用于測定碳水化合物和總脂含量，碳水化合物含量測定采用苯酚-硫酸法[15]，總脂含量采用氯仿甲醇法[16]，之后采用BF3甲酯化法[17]測定脂肪酸含量，使用Agilent-7890A型氣相色譜儀聯(lián)合Agilent-5975C質(zhì)譜儀分析脂肪酸，根據(jù)脂肪酸標準品的分析圖譜、保留時間以及質(zhì)譜的分析對脂肪酸進行定性分析，并按照峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，通過單因素方差分析和Duncan’s多重比較來評估各組實驗數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05表示數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)都使用SPSS 17.0進行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照度對綠球藻生長的影響

由圖1可知，不同光照度對綠球藻生長影響不同，綠球藻在無光條件下(0 lux)沒有生長，第3天藻細胞密度出現(xiàn)降低的趨勢，顯著低于其它各組；在光照條件下，1 500和3 000 lux組綠球藻經(jīng)過1天的生長延緩期后開始進入指數(shù)增長期，之后進入穩(wěn)定期，分別在第6天和第4天達到最大值24.69×106和22.93 ×106cells/mL，明顯高于其它各組；隨著光照度的進一步增加，4 500、6 000和7 500 lux組延緩期延長，綠球藻細胞密度降低。因此該綠球藻在無光條件下無法生長，在低光照條件下生長較好，高光照條件下生長受到抑制。

圖1 不同光照度對綠球藻細胞密度的影響

由表1可知，綠球藻在光照度為0 lux時，特定生長率最小，為0.03，顯著低于其它各組，隨著光照度的增加，特定生長率先增大后減小，在光照度為1 500 lux達到最大值0.24，顯著高于6 000和7 500 lux組。隨著光照度的增加，綠球藻生物量先增大后減小，0 lux組生物量顯著低于其余各組，當光照度為1 500和3 000 lux時，綠球藻具有較高的生物量，分別為0.47、0.44 g/L，顯著高于其它各組。由此可知，綠球藻最佳生長所需光照度為1 500～3 000 lux。

表1 不同光照強度對綠球藻特定生長率、生物量和類胡蘿卜素/葉綠素的影響

2.2 不同光照強度對綠球藻營養(yǎng)成分含量的影響

綠球藻細胞色素含量受光照度的影響，由圖2可知，隨著光照度的增加，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，光照度為3 000 lux時色素含量較高，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別為0.41%、0.06%、0.10%，與1 500 lux組無顯著差異，但顯著高于其它各組。在光照條件下，隨著光照強度的增加，綠球藻類胡蘿卜素/葉綠素比值增大(見表1)，7 500 lux組達到最大值0.23，顯著高于1 500、3 000和4 500 lux組。

圖2 不同光照強度對綠球藻色素含量的影響

由圖3可知，隨著光照度的增加，總脂含量在0 lux組有最大值17.53%，顯著高于其它各組，隨著光照度從1 500增加到7 500 lux，總脂含量無顯著變化；碳水化合物含量在0 lux組顯著低于其它各組，其余各組之間無顯著差異。

圖3 不同光照強度對綠球藻總脂和碳水化合物的影響

光照度影響綠球藻的脂肪酸類型和含量，對綠球藻脂肪酸組成測定結(jié)果見表2，綠球藻中主要含有C16和C18脂肪酸，其中C16 ∶0、C18 ∶2n6(亞油酸LA)、C18 ∶3n3(亞麻酸ALA)含量較高。隨著光照度的增加，C14 ∶0、C16 ∶0、C18 ∶0、C16 ∶1、C17 ∶1含量降低，從而導(dǎo)致飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)含量減??；0～3 000 lux，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量隨著光照度的增大逐漸提高，當光照度大于3 000 lux后不再有顯著性變化；隨著光照度的增加，LA含量先增大后減小，在光照度為1 500 lux時達到最大值25.46%，ALA含量隨著光照度的增加而增加，當光照度大于4 500 lux時不再變化，維持在43%～44%左右。

表2 不同光照強度對綠球藻脂肪酸組成的影響(%總脂肪酸)

3 討論

本研究結(jié)果表明該綠球藻在無光照條件下無法生長，特定增長率幾乎為0，說明該綠球藻不能進行異養(yǎng)生長。當光照度為1 500 lux時，綠球藻細胞密度、特定生長率和生物量提高并達到最大值，隨著光照度增加到3 000 lux，綠球藻不再進一步生長，當光照度從4 500 lux增加到7 500 lux，綠球藻生長下降，表明低光照促進綠球藻生長，高光抑制生長，這與大多數(shù)微藻具有相同的特性，如斜生柵藻(ScenedesmusobliquusCNW-N)[18]、微綠球藻(Nannochloropsissp.)[7]、凱氏擬小球藻(Chlorellakessleri)[19]等。在無光或低光照度下，微藻生長往往處于光限制狀態(tài)，光照度的增加會促進微藻的生長，直到達到飽和光照度。然而，當光照度超過飽和光度時，通常會導(dǎo)致Fv/Fm比值急劇下降，對光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)造成光氧化損傷，即發(fā)生光抑制現(xiàn)象[20-21]，降低光合效率，從而降低生物量的生產(chǎn)，這與Khoeyi等[22]、Chen等[23]的研究結(jié)果相一致。根據(jù)實驗結(jié)果可以推測綠球藻達到光飽和點所需光照強度為3 000 lux左右，綠球藻培養(yǎng)所需適宜的光照強度為1 500～3 000 lux。

色素是微藻捕光和傳遞光量子的重要成分，與光合作用效率密切相關(guān)。綠藻中主要存在葉綠素和類胡蘿卜素兩類色素。本研究結(jié)果表明，當光照度從0增加到3 000 lux，綠球藻葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均不斷提高，這是由于在光限制條件下，藻類可以通過增加光合單位的數(shù)量及光捕獲色素蛋白復(fù)合體的大小來增加細胞的色素[24-25]，提高采光能力，使光合速率維持在較高水平。當光照度超過3 000 lux，綠球藻各色素含量開始逐漸下降，其原因主要是在高光照度下，細胞不需要較高的色素來捕獲光量子，并通過降低色素含量減少對光的吸收，從而避免光氧化損傷[26-27]。類胡蘿卜素除了具有捕光功能外，在保護藻細胞免受光抑制中發(fā)揮著主要作用，本研究結(jié)果表明，在光照條件下，隨著光照度的增加，類胡蘿卜素/葉綠素之比逐漸增大，這與對杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)[28]的研究結(jié)果類似。當受到過度光照脅迫時，藻類往往能夠增加類胡蘿卜素的組成比例來應(yīng)對自身的氧化損傷，參與光保護過程。因此，在持續(xù)高光度下，葉綠素比類胡蘿卜素下降更快，所以導(dǎo)致類胡蘿卜素/葉綠素比值增大。

脂質(zhì)和碳水化合物是微藻主要的儲能形式[29]，研究表明微藻將獲得的能量用于脂類和碳水化合物的生物合成過程存在競爭關(guān)系，與脂質(zhì)相比，碳水化合物的合成所需的ATP和NAD(P)H更少，微藻會將碳和能量傾向于碳水化合物的合成[30]。本研究結(jié)果表明，在無光照條件下脂質(zhì)和碳水化合物含量相近，綠球藻無法利用光照和葡萄糖獲取能量，不存在這種競爭關(guān)系，但在光照條件下，綠球藻總脂含量降低，碳水化合物含量升高，差異增大，說明綠球藻能夠?qū)墓庹蘸推咸烟侵蝎@得的能量優(yōu)先轉(zhuǎn)化為用于碳水化合物的合成。

C16和C18系列脂肪酸是藻類細胞合成的主要脂肪酸[31]。光照度對微藻脂肪酸組成和含量的影響因種而異，大多數(shù)研究表明較高的光照度能夠促進SFA和MUFA的合成，降低PUFA的合成[31-33]。本研究結(jié)果表明，隨著光照度的增加，綠球藻SFA和MUFA均出現(xiàn)了不同程度的下降趨勢，而PUFA含量卻顯著提高，尤其是ALA，這與Krzeminska等[32]研究結(jié)果不同，但與Liu等[34]研究結(jié)果一致。光能夠誘導(dǎo)基質(zhì)中的pH、Mg2+和NADPH的變化，最終影響和調(diào)節(jié)脂肪酸合成過程中關(guān)鍵酶的活性[35]。PUFA是光合膜的重要組成成分，在維持光合膜的結(jié)構(gòu)完整和功能方面發(fā)揮著重要作用，隨著光照度的增加，微藻能夠通過加速D1蛋白的合成來完成脂肪酸的去飽和，從而提高藻細胞對光的耐受能力[36-37]。另一方面，碳鏈的去飽和過程中需要分子氧的參與[38]，隨著光照度的增加，綠球藻光合效率提高，產(chǎn)生更多的分子氧，加速碳鏈的去飽和，從而促進PUFA的合成，當光照達到飽和點后，PUFA不再增加。因此，在低光照度下，有利于綠球藻SFA和MUFA的合成，在高光照度下，有利于PUFA的合成。

綜上，綠球藻在光照度為3 000 lux生長時可獲得較高的細胞密度和生物量，同時，綠球藻色素、碳水化合物和PUFA含量也維持在較高水平。