熊文華 李新瑞 王真真 孫美玲*

（湖北大學(xué)知行學(xué)院，湖北武漢 430011）

酵母菌是一種單細(xì)胞真菌，在自然界分布廣泛，主要生長(zhǎng)在偏酸性、潮濕的含糖環(huán)境中。酵母菌是兼性厭氧微生物，是發(fā)酵的原動(dòng)力，在氧氣充足的條件下生長(zhǎng)繁殖旺盛，但在缺氧條件下可將糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳。研究采用了項(xiàng)目組從野生柑橘中分離、篩選獲得的ZGJ-1 高產(chǎn)酒菌株與其他3 種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵性能對(duì)比，旨在篩選出發(fā)酵快、品質(zhì)優(yōu)良的果酒專用酵母菌。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌種與材料

ZGJ-1（以下簡(jiǎn)稱1 號(hào)菌株）：項(xiàng)目組從自然界中分離純化獲得的發(fā)酵特性好、高產(chǎn)酒的酵母菌株；2 號(hào)酵母菌株：市售安琪酵母菌；3 號(hào)酵母菌株：項(xiàng)目組從高溫白云邊酒曲分離純化獲得；ZGJ-4（以下簡(jiǎn)稱4 號(hào)菌株）：項(xiàng)目組從自然界中分離純化獲得產(chǎn)海藻糖的釀酒酵母菌株（專利號(hào)ZL201710503931.7）。

瓊脂、酵母粉、果膠酶，上海盛思生化科技有限公司；淀粉、尿素、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀，天津市鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)器材

高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、移液槍、接種環(huán)、電子天平、試管、燒杯、玻璃棒、量筒、稱量紙、錐形瓶、電磁爐等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的配制

YPD 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1 g 酵母粉，2 g 蛋白胨，2 g 瓊脂，5 g 葡萄糖，蒸餾水100 mL，于115 ℃滅菌15 min。

不同糖濃度YPD 固體培養(yǎng)基：在上述YPD 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加3 g、6 g、9 g 葡萄糖，于115 ℃滅菌15 min。

不同SO2含量的YPD 固體培養(yǎng)基：在上述YPD 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別添加0.01 g、0.03 g、0.06 g 偏重亞硫酸鉀，于115 ℃滅菌15 min。

YEPD 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1 g 酵母粉，2 g 蛋白胨，蒸餾水100 mL，于115 ℃滅菌15 min。

不同碳源YEPD 液體培養(yǎng)基：在上述YEPD 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同類型的碳源（葡萄糖、糊精、麥芽糖、蔗糖） 各5 g，于115 ℃滅菌15 min。

不同氮源YEPD 液體培養(yǎng)基：在上述YEPD 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同類型的氮源（尿素、酵母粉、蛋白胨） 各5 g，于115 ℃滅菌15 min。

2.2 耐受能力的測(cè)定

2.2.1 耐高糖試驗(yàn)

按照上述步驟配制不同糖濃度的YPD 固體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌倒平板，待凝固后分別在含糖量不同的平板上接種1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株，倒置放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)72 h，觀察菌落數(shù)。

2.2.2 耐SO2試驗(yàn)

按照上述步驟配制不同含量SO2的YPD 固體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌倒平板，待凝固后分別在不同SO2含量的平板上接種1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株，倒置放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)72 h，觀察菌落數(shù)。

2.2.3 耐高溫試驗(yàn)

按照上述步驟配制YPD 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌倒平板，待凝固后分別在平板上接種1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)菌株，倒置放入27 ℃、32 ℃、37 ℃的不同恒溫箱培養(yǎng)72 h，觀察菌落數(shù)。

2.3 同化碳源、氮源能力的測(cè)定

2.3.1 同化碳源能力的測(cè)定

按照上述步驟配制含不同類型碳源的YEPD 液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌冷卻后分別按5%接種量，接入1 號(hào)菌、2 號(hào)菌、3 號(hào)菌、4 號(hào)菌，放入28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 搖床中震蕩培養(yǎng)72 h，取培養(yǎng)液裝于50 mL 離心管中以10 000 r/min 離心10 min，收集酵母細(xì)胞，用無(wú)菌水洗滌3 次，烘干后稱干重。

2.3.2 同化氮源能力的測(cè)定

按照上述步驟配制含不同類型氮源的YEPD 液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌冷卻后分別按5%接種量，接入1 號(hào)菌、2 號(hào)菌、3 號(hào)菌、4 號(hào)菌，放入28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 搖床中震蕩培養(yǎng)72 h，取培養(yǎng)液裝于50 mL 離心管中以10 000 r/min 離心10 min，收集酵母細(xì)胞，用無(wú)菌水洗滌3 次，烘干后稱干重。

3 結(jié)果與分析

3.1 耐受能力的測(cè)定

3.1.1 耐高糖試驗(yàn)結(jié)果

不同酵母菌耐高糖試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 耐高糖試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1 菌落生長(zhǎng)狀況來(lái)看，最適合酵母菌生長(zhǎng)的糖濃度為6 g，尤其1 號(hào)、2 號(hào)酵母菌生長(zhǎng)旺盛，糖濃度過高或過低均會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。在發(fā)酵過程中酵母菌主要利用糖生成乙醇和二氧化碳，所以糖濃度在發(fā)酵過程中是一項(xiàng)重要指標(biāo)，直接影響著發(fā)酵產(chǎn)率和產(chǎn)物品質(zhì)。

3.1.2 耐SO2試驗(yàn)結(jié)果

不同酵母菌耐SO2試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 耐SO2 試驗(yàn)結(jié)果

SO2在果酒中的主要作用是殺菌，但過量的SO2會(huì)抑制酵母菌生長(zhǎng)，所以在發(fā)酵過程中要嚴(yán)格控制SO2的用量。

由表2 可知，當(dāng)SO2添加量為0.1 g 時(shí)，1 號(hào)菌珠生長(zhǎng)最旺盛，隨著添加量的增加，酵母菌活性下降。

3.1.3 耐高溫試驗(yàn)結(jié)果

不同酵母菌耐高溫試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 耐高溫試驗(yàn)結(jié)果

溫度是影響酵母生長(zhǎng)繁殖的一個(gè)重要因素。由表3 可知，當(dāng)溫度為27 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，但隨溫度的升高，菌體密集度反而降低，因此，果酒酵母的最適生長(zhǎng)溫度為27 ℃。

3.2 同化碳源、氮源能力的測(cè)定

3.2.1 同化碳源能力的測(cè)定結(jié)果

不同酵母同化碳源能力的測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 同化碳源能力的測(cè)定結(jié)果

碳源是酵母生長(zhǎng)所需的重要物質(zhì)。酵母對(duì)碳源的利用具有選擇性,不同碳源對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響程度也不一樣。1 號(hào)酵母對(duì)葡萄糖和蔗糖利用最好，麥芽糖次之，對(duì)糊精的利用率最差。由表4 可知，3號(hào)酵母菌同化糊精的能力最強(qiáng)，菌體的干重遠(yuǎn)大于麥芽糖、葡萄糖、蔗糖等。

3.2.2 同化氮源能力的測(cè)定結(jié)果

不同酵母同化氮源能力的測(cè)定結(jié)果見表5。

氮源是釀酒酵母生長(zhǎng)所需的另一重要物質(zhì)，釀酒酵母對(duì)氮源的利用具有選擇性。由表5 可知，1 號(hào)酵母菌同化尿素的能力最強(qiáng)，酵母粉次之，尿素相差不大；3 號(hào)酵母菌同化酵母粉的能力最強(qiáng)，同化尿素的能力最差；4 號(hào)酵母菌同化蛋白胨的能力最強(qiáng)。

表5 同化氮源能力的測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

本文研究了各因素對(duì)酵母菌株發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，專利菌株ZGJ-1 的生長(zhǎng)特性（耐高滲、耐SO2、耐高溫）、同化氮源、碳源能力明顯優(yōu)于其他類型的釀酒酵母菌。但試驗(yàn)內(nèi)容不具備全面性，后期項(xiàng)目組還將展開對(duì)專利菌株的動(dòng)力學(xué)模型、發(fā)酵特性等各方面的研究，此次試驗(yàn)操作過程中發(fā)現(xiàn)必須控制雜菌（如醋酸菌、乳酸菌、霉菌） 的生長(zhǎng)，滅菌要徹底，不然會(huì)嚴(yán)重影響菌株純種特性的研究結(jié)果。