涂琦 ，楊軍平 ，楊小軍 ，周建 ，曹麗華

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，1.病理科；2.檢驗科，南昌 330006）

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)時常常處于中晚期， 預(yù)后不佳。 目前的研究表明，包括GADD45a 在內(nèi)的多種通道的激活可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，但機(jī)制不明。此前的研究中,發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號通路參與調(diào)控GADD45a[1]。為明確結(jié)直腸癌中PI3K-AKT 信號通路中GADD45a作用機(jī)制，選擇PI3K-AKT-GADD45a 信號通路關(guān)鍵分子PI3K、p-p38， 使用免疫組織化學(xué)的方法檢測結(jié)直腸癌、 正常腸黏膜組織中GADD45a、PI3K和p-p38 的表達(dá)， 探討三者與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集 2009 年 1 月-2014 年 12 月江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科123 例結(jié)直腸癌標(biāo)本， 另選取基本正常結(jié)直腸黏膜組織60 例作為對照。 根據(jù)WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類， 由兩位資深病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法重新閱片診斷。 患者男 65 例，女 58 例；年齡 26-83 歲，平均59.65 歲；腫瘤直徑＜5cm 者 87 例，≥5cm 者 36 例；分化程度：高分化12 例，中分化93 例，低分化18例； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者54 例， 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69 例。TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期 66 例， Ⅲ+Ⅳ期 57 例。 納入標(biāo)準(zhǔn):⑴術(shù)前均未接受放、化療；⑵有完整的臨床和隨訪資料（隨訪截止日期2019 年12 月30 日）。

1.2 試劑 GADD45a 多克隆抗體（D122400，上海生工生物工程股份有限公司），PI3K(sc-1637，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司）、p-p38(sc-7973，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司），CFDA 免疫組化檢測試劑盒（GK6007）購自基因科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué) ⑴組織芯片制作：從123 例結(jié)直腸癌和60 例基本正常結(jié)直腸黏膜組織對照HE切片選取1mm 圓柱形組織， 將其放入空白蠟塊孔中，55°C 溫箱中烤 1h，完全融合后，室溫冷卻，備用切片。 ⑵采用EnliVision 法免疫組織化學(xué)染色：在123 例結(jié)直腸癌60 例正常結(jié)直腸黏膜組織中進(jìn)行 GADD45a、PI3K、p-p38 免疫組織化學(xué)染色。使用防脫石蠟切片，切片經(jīng)60°C 恒溫烤箱中烤片2h；脫蠟、水化、消除內(nèi)源性過氧化物酶，使用高壓加熱抗原修復(fù)法， 加一抗 GADD45a（1：30）、PI3K(1：50)、p-p38 (1：50)4°C 孵育過夜；PBS 沖洗除去PBS， 每滴加聚合物增強(qiáng)劑孵育20min，PBS 沖洗；二抗室溫下孵育30min；DAB 溶液顯色自來水沖洗1min，蘇木素復(fù)染，分化、返藍(lán)；脫水、透明、中性樹膠封片；為防止出現(xiàn)假陽性和假陰性的可能，免疫組織化學(xué)實驗采用陽性對照和采用空白對照和組織內(nèi)對照作為陰性對照進(jìn)行嚴(yán)格地質(zhì)量控制。

1.4 結(jié)果判斷 進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色判讀GADD45a 主要表達(dá)于細(xì)胞核，PI3K 陽性為細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核;p-p38 表達(dá)于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)。 參照Takebayashi 標(biāo)準(zhǔn)， 每張切片先在低倍鏡（x100）下觀察，表達(dá)較強(qiáng)的區(qū)域，再切換至高倍鏡（x200）下觀察， 選取3 個高倍視野， 計算陽性細(xì)胞百分比，參考半定量積分法，對結(jié)果進(jìn)行評判：⑴按照切片中陽性細(xì)胞百分比記分：陽性細(xì)胞數(shù)為陰性，記0 分；陽性細(xì)胞數(shù)為l%-10%，記1 分；陽性細(xì)胞數(shù)為11%-50%，記2 分；陽性細(xì)胞數(shù)為51%-75%，記 3 分,陽性細(xì)胞數(shù)為＞75%，記 4 分;⑵再根據(jù)細(xì)胞染色的強(qiáng)弱記分：與背景色一致，陽性細(xì)胞幾乎沒有染色計0 分； 陽性強(qiáng)度染色比背景色略高為淡黃色計1 分；明顯高于背景色為棕黃色計2 分；染色明顯為棕褐色計3 分。 然后按照陽性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)弱計積分，≥3 分為陽性表達(dá)，＜3 分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸黏膜中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系分析采用χ2檢驗。 相關(guān)性檢驗采用Spearman 相關(guān)性分析。 單因素生存分析使用Kaplan-Meier 法，多因素生存分析采用Cox 風(fēng)險回歸模型分析，組間比較采用log-rank 檢驗。 P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白在結(jié)直腸癌、正常結(jié)直腸黏膜中的表達(dá) 結(jié)直腸癌組織中GADD45a 的表達(dá)水平低于正常結(jié)直腸黏膜組織，結(jié)直腸癌組織中PI3K 和p-p38 的表達(dá)水平高于正常結(jié)直腸黏膜組織，差異有顯著性(P＜0.01)。 （表1，圖1）

表1 GADD45a、PI3K 和p-p38 在結(jié)直腸癌與正常結(jié)直腸黏膜中的表達(dá)[n(%)]

圖1 結(jié)直腸癌與正常結(jié)直腸黏膜中GADD45a、PI3K 和p-p38的表達(dá)，EnliVision 法:A GADD45a 在正常腸黏膜組織中呈陽性表達(dá)（IHC×200）；B PI3K 在正常結(jié)直腸黏膜中呈陰性表達(dá)（IHC×200）；C p-p38 在正常結(jié)直腸黏膜中呈陰性表達(dá)（IHC×200）；D GADD45a 在結(jié)直腸癌組織中呈陰性表達(dá)（IHC×200）；E PI3K 在結(jié)直腸癌組織中呈陽性表達(dá)（IHC×400）；F p-p38 在結(jié)直腸癌組織中呈陽性表達(dá)（IHC×400）

2.2 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征相互關(guān)系 PI3K 的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無、腫瘤TNM 分期有相關(guān)性 （P ＜0.05）， 與 其 他 臨 床 病 理 學(xué) 參 數(shù) 無 關(guān) 。GADD45a 和p-p38 的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)無關(guān)（P＞0.05）。 （表2）

2.3 結(jié)直腸癌中 GADD45a 與PI3K、p-p38 蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性 GADD45a 陽性表達(dá)組中，PI3K陰性表達(dá)比例高于PI3K 陽性表達(dá)，但統(tǒng)計學(xué)無差異(P＞0.05)。 Spearman 相關(guān)分析顯示，GADD45a 與p-p38 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)（表3）。

2.4 生存分析 123 例結(jié)直腸癌患者中位生存時間為 60 個月， 平均 5 年生存率為 66.7%。 Kaplan-Meier 生存曲線顯示，GADD45a 蛋白陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總生存時間高于GADD45a 蛋白陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖2A)。 PI3K、p-p38 蛋白陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總生存時間分別低于蛋白PI3K、p-p38 陰性表達(dá)者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖2B、2C)。 Cox 回歸模型分析顯示GADD45a 陰性表達(dá)、TNM 分期、 腫瘤大小是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素（表4）。

表2 GADD45a、PI3K 和p-p38 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性

表3 結(jié)直腸癌中GADD45a 與PI3K、p-p38 蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，位列癌癥相關(guān)死亡原因第四位， 死亡率占全部惡性腫瘤死亡率的8%[2]。 對臨床而言，了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有助于確定新的診斷和預(yù)后分子標(biāo)志， 并能提供具有價值的臨床治療分子靶點，具有實現(xiàn)結(jié)直腸癌個體化診治的重要意義。

生長阻滯和DNA 損傷基因 (growth arrest and DNA damage)于1988 年克隆自經(jīng)紫外線照射后的中國倉鼠卵巢細(xì)胞[3]。GADD45a 基因位于1 號染色體 （1p31.2-p31.1） 編碼一個分子量約18.4kDa 大小,具有165 個氨基酸的DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白,其作用與DNA 損傷修復(fù)、 細(xì)胞凋亡、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。GADD45a 在多種腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)改變, 乳腺癌表達(dá)較相應(yīng)正常組織降低[4],非小細(xì)胞肺癌[5]表達(dá)未見明顯差異,而在胰腺導(dǎo)管腺癌[6]中表達(dá)卻增高。本實驗中結(jié)直腸癌組織中GADD45a 的表達(dá)水平低于正常結(jié)直腸黏膜組織差異且有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 不同的腫瘤中，GADD45a 表達(dá)水平表現(xiàn)不同，可能與腫瘤形成和發(fā)展機(jī)制及GADD45a 在不同信號通路相互作用和交叉對話中起作用不同或與實驗方法和樣本選擇不同有關(guān)。 在多種損傷因素如紫外線照射、電離輻射、烷化劑、營養(yǎng)缺失、化療藥物等作用下，GADD45a 可以依賴和非依賴p53 的方式表達(dá)上調(diào)。依賴P53 方式中，PI3K-AKT信號通路參與調(diào)控GADD45a，抑制AKT 的活性可誘導(dǎo)GADD45a 的基因表達(dá)[1]。 AKT 激活后可通過磷酸化作用激活或抑制下游的靶基因[7],包括：Casp ase9、NF-κB、mTOR、P21、FOXO3a 等。 FOXO3a 可激活下游組件GADD45a， 引起細(xì)胞G2/M 期生長阻滯[8]。在PI3K/Akt 信號通路選擇性抑制劑的干擾下，肝癌細(xì)胞中sCLU 和Gadd45a 的表達(dá)無明顯變化。 而Gadd45a 表達(dá)的調(diào)節(jié)可以影響Akt 的磷酸化水平[9]。 有研究發(fā)現(xiàn)，Myc 和 PI3K/AKT 協(xié)同抑制GADD45a 的表達(dá)[10]。 本實驗中，GADD45a 陽性表達(dá)組中，PI3K 陰性表達(dá)比例高于PI3K 陽性表達(dá)，但統(tǒng)計學(xué)無差異(P＞0.05)。 此結(jié)果與多信號通路協(xié)同作用有關(guān)，或是與樣本量有關(guān)需待進(jìn)一步研究。

表4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后多因素生存分析（n=123）

p38、ERK1/2、JNK 磷酸化已被證明能促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]，cyclinD1 也被證明與結(jié)直腸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。 本實驗中，p-p38 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)直腸黏膜，證明p38 磷酸化與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，GADD45a 基因敲除細(xì)胞可顯著降低細(xì)胞活力，加劇DNA 損傷，增加S 期阻滯，與p-p38、p-JNK 的顯著激活有關(guān)，而與 p-ERK 無關(guān)[13]。 其發(fā)生機(jī)制可 能與 GADD45α 對 通過上 調(diào)PP2Cα 的表達(dá)，對 MKK-JNK/p38 /AP-1 通路的抑制作用有關(guān)[14]。 本實驗通過Spearman 相關(guān)分析顯示 GADD45a 與 p-p38 表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (P＜0.05)，可能與上述機(jī)制有關(guān)，需待相關(guān)實驗證實。 p-p38 在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高， 且被認(rèn)為是預(yù)后差的危險因素[15]。 本實驗中發(fā)現(xiàn)，p-p38 蛋白陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總生存時間低于p-p38 蛋白陰性表達(dá)者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

在多種腫瘤中，GADD45a 與腫瘤預(yù)后相關(guān)，食管癌[16]、乳腺癌[4]GADD45a 陽性表達(dá)生存率高，GA DD45a 的高表達(dá)與AML 患者的DFS 中位數(shù)最低相關(guān)[17]。 本實驗中Kaplan-Meier 生存曲線顯示，GADD45a 蛋白陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總生存時間高于GADD45a 蛋白陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Cox 回歸模型分析顯示 GADD45a 陰性表達(dá)、TNM 分期、腫瘤大小是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中GADD45a 的陰性表達(dá)可能與p-p38 激活有關(guān)，GADD45a 陰性表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后的危險因素,可作為結(jié)直腸癌預(yù)后潛在分子標(biāo)志物。 本實驗通過免疫組織化學(xué)的方法對 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白表達(dá)進(jìn)行評估， 并對蛋白表達(dá)相關(guān)性及其臨床意義進(jìn)行初步觀察和探討， 今后需增加樣本量并對其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究， 以揭示其分子機(jī)制。 深入研究GADD45a 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，對腫瘤監(jiān)測、診斷、藥物開發(fā)及預(yù)后等方面具有價值。