藍(lán)肇煜，王小月，李丹，武靜橋，范真瑋，姚景麗，趙微，何敬文，陳婷，金天明

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤稱為乳腺癌(breast cancer)。乳腺腫瘤是雌性動(dòng)物中最常見(jiàn)的腫瘤，特別是小動(dòng)物的重要臨床疾病之一[1]。犬是乳腺腫瘤發(fā)病率最高的動(dòng)物，未絕育的母犬發(fā)病率高達(dá)71%[2]。采用常規(guī)腫瘤治療方法后，高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌病畜仍會(huì)死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，尋找合適的載體和治療藥物將會(huì)極大改善乳腺癌對(duì)雌性動(dòng)物的傷害。

研究顯示，實(shí)體瘤有一個(gè)顯著特性，即伴隨著腫瘤的快速生長(zhǎng)，導(dǎo)致供氧不足，在其內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)低氧區(qū)(氧含量為1%，正常組織中為3%～15%)。腫瘤低氧區(qū)的存在形成了天然的厭氧環(huán)境，又由于腫瘤內(nèi)部的免疫抑制作用，壞死區(qū)中細(xì)胞裂解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及新生血管破裂等原因，為兼性或厭氧菌生長(zhǎng)提供了有利環(huán)境，使有些厭氧菌或兼性厭氧菌可以靶向腫瘤，并在腫瘤中生長(zhǎng)，這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示著某些厭氧菌或兼性厭氧菌有望成為攜帶抗腫瘤藥物的載體，這其中尤以沙門菌為典型代表[3]。減毒菌株鼠傷寒沙門菌LH430(phoP/phoQ基因缺失)在敲除了鼠傷寒沙門菌的phoP/phoQ基因后，菌株毒力與親本菌株相比大為降低，但仍保留了親本菌株的侵襲力，是適宜的疫苗及載體候選菌株[4]。

腫瘤靶向肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是細(xì)胞能夠識(shí)別的最小的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上所特有的結(jié)構(gòu)單位，可有效識(shí)別腫瘤血管整合素αvβ3[5]。由于乳腺癌細(xì)胞表面存在整合素αvβ3，RGD能夠高度靶向乳腺癌細(xì)胞，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

細(xì)胞穿膜肽(CPPs)又稱蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)，是一組不超過(guò)35個(gè)氨基酸殘基，可有效地內(nèi)化細(xì)胞，攜帶偶聯(lián)藥物進(jìn)入細(xì)胞的小肽，且不引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。TAT是一種11聚體的細(xì)胞穿膜肽，來(lái)源于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)編碼的轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白，是保持細(xì)胞穿膜能力的最小蛋白，也是自發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽以來(lái)研究和使用最廣泛的肽。

白樹毒素(gelonin，簡(jiǎn)稱GEL)是一種Ⅰ型核糖體失活蛋白(RIPs)，單鏈核糖體失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，可專一性水解真核細(xì)胞核糖體28S rRNA中第4 324位腺苷酸的N-C鍵，釋放1個(gè)腺嘌呤(A)使核糖體失活，從而抑制蛋白質(zhì)生物合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6-7]。同時(shí)，GEL又具有類 DNase 活性，可使細(xì)胞核中 DNA降解[8]。

本研究選擇GEL基因作為乳腺癌的治療基因，同時(shí)利用LH430和RGD對(duì)腫瘤細(xì)胞的雙靶向作用及TAT細(xì)胞穿透作用，構(gòu)建了攜帶RGD-TAT-GEL三基因的減毒沙門菌，增強(qiáng)GEL基因的穿透細(xì)胞能力，使其更高效地殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，借助雙靶向作用，可進(jìn)一步降低GEL基因?qū)φ＜?xì)胞的損傷，從而實(shí)現(xiàn)靶向抑瘤的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料

沙門菌LH430由吉林大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231由天津師范大學(xué)朱長(zhǎng)軍教師惠贈(zèng)；含質(zhì)粒pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL和pMD-RGD-GEL的重組大腸桿菌由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HEK-293細(xì)胞和pEGFP-N1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

TRIzol Reagent購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小提試劑盒、SanPrep 柱式 DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 中 RGD 基因序列(1FUL_A)、TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設(shè)計(jì)RGD-TAT-GEL基因引物；根據(jù)RGD基因序列(1FUL_A)和GEL基因序列(AAB47013.1)設(shè)計(jì)RGD-GEL基因引物；根據(jù)TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設(shè)計(jì)TAT-GEL基因引物，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物信息

1.3 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質(zhì)粒制備與鑒定

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取大腸桿菌中的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ分別進(jìn)行雙酶切。回收RGD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因和真核表達(dá)載體pEGFP-N1雙酶切產(chǎn)物。采用T4連接酶將回收的目的基因與載體16 ℃連接過(guò)夜，并測(cè)序。

1.4 重組沙門菌的構(gòu)建

將減毒沙門菌LH430轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞，按照文獻(xiàn)[9]方法將質(zhì)粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL和pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)化至LH430感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性菌株，利用引物F1/R1對(duì)RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因進(jìn)行PCR鑒定，引物F2/R1對(duì)TAF-GEL基因進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性重組菌分別命名為 LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組減毒沙門菌侵染MDA-MB-231細(xì)胞及外源基因檢測(cè)

將MDA-MB-231細(xì)胞分為5組，每組3孔，每孔1×105個(gè)細(xì)胞加入6孔板中，并加入2 mL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合度至70%～80%時(shí)，PBS洗滌2次，用無(wú)血清無(wú)抗DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，每組分別加入50 μL(1×106CFU/mL)LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP，置于 5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃孵育3 h，PBS洗滌2次，每孔加入10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液2 mL，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h后，換為無(wú)血清無(wú)抗DEME培養(yǎng)液，培養(yǎng)6～48 h后，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。采用 TRIzol法從侵染 48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞中提取細(xì)胞總 RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA后，以其為模板，分別以 F1/R1、F2/R1為引物，PCR 檢測(cè)目的基因。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；73 ℃ 15 min。

1.6 CCK-8法檢測(cè)重組沙門菌對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將MDA-MB-231細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞各分5組，分別重懸于含10% FBS的DMEM和MEM完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，于96孔板中加入100 μL細(xì)胞懸液，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度至60%時(shí)，換為無(wú)血清無(wú)抗DMEM培養(yǎng)基，每組加入LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP各10 μL，每個(gè)重組菌用無(wú)血清無(wú)抗培養(yǎng)液依次稀釋1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h。到達(dá)檢測(cè)時(shí)間時(shí)，于每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光吸收值。

使用GraphPad Prism軟件繪制抑制率圖表，通過(guò)SPSS軟件用One-way ANOVA方法計(jì)算抑制率和標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS軟件中的Probit分析CCK-8結(jié)果計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值并用One-way ANOVA方法計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差。抑制率計(jì)算方法：各重復(fù)孔的OD值取“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，用1-(OD值-空白OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值-空白OD值)×100%獲得各種藥物的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質(zhì)粒的鑒定

將提取后的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ進(jìn)行雙酶切。將膠回收的基因片段經(jīng)T4連接酶連接后，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符，表明上述重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 構(gòu)建重組沙門菌的鑒定

將含質(zhì)粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL的重組減毒沙門菌，進(jìn)行PCR鑒定，獲得857、824和830 bp的預(yù)期目的片段(圖1)，表明成功構(gòu)建重組減毒沙門菌。

M.250 bp-Ⅰ DNA ladder；1.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL(857 bp)；2.LH430/pEGFP-TAT-GEL(830 bp)；3.LH430/pEGFP-RGD-GEL(824 bp)

2.3 重組減毒沙門菌侵染MDA-MB-231細(xì)胞檢測(cè)

重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL侵染MDA-MB-231細(xì)胞24、48和72 h后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖2)。經(jīng)LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL侵染的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光最明顯。

a.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL; b.LH430/pEGFP-TAT-GEL; c.LH430/pEGFP-RGD-GEL; d.LH430/pEGFP-N1

2.4 RT-PCR檢測(cè)目的基因

PCR檢測(cè)重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL中的RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因，在857、824和830 bp處獲得目的片段(圖3)，表明重組菌在MDA-MB-231細(xì)胞中成功表達(dá)RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因。

M.250 bp-Ⅰ DNA ladder; 1.RGD-GEL(824 bp); 2.TAT-GEL(830 bp); 3.RGD-TAT-GEL(857 bp)

2.5 CCK-8法檢測(cè)重組沙門菌對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.5.1 不同時(shí)間濃度重組菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制效果

重組減毒沙門菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制力隨劑量增加而增強(qiáng)，但沒(méi)有出現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴性，LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組48 h時(shí)抑制率為68%，顯著高于其他組(P<0.05)(圖4)。

A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL；B.LH430/pEGFP-RGD-GEL；C.LH430/pEGFP-TAT-GEL；D.LH430/pEGFP-N1；同一處理組間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.5.2 不同時(shí)間濃度重組菌對(duì)HEK-293細(xì)胞的抑制效果

重組減毒沙門菌對(duì)HEK-293細(xì)胞的抑制力普遍較低，明顯低于對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制力，且沒(méi)有出現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴性(圖5)。說(shuō)明重組菌對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向性較好，對(duì)正常細(xì)胞損傷較小。

A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL；B.LH430/pEGFP-RGD-GEL；C.LH430/pEGFP-TAT-GEL；D.LH430/pEGFP-N1

2.6 各組重組菌對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50值

將CCK-8數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并計(jì)算各重組菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的IC50值。結(jié)果顯示LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值最低，為(4.643±0.514)×107CFU/μL，對(duì)HEK-293細(xì)胞的IC50值最高，為(2.376±0.260)×109CFU/μL，說(shuō)明其抑瘤效果最佳，且對(duì)正常細(xì)胞損傷較小(圖6)。

圖6 各重組菌對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的IC50值分析結(jié)果

3 討論

目前，癌癥治療的主要障礙是藥物的低效力，因此，人們更多地利用蛋白質(zhì)或基因開展腫瘤治療研究，然而，這些大分子卻不能穿透細(xì)胞膜[10]。研究表明，PTDs是將生物活性大分子傳遞到完整細(xì)胞中最有效的工具，能夠?qū)⑿》肿铀幬?、大分子甚至納米顆粒送入所有類型的細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制強(qiáng)于其他內(nèi)化途徑[11]。Shin等[12]的研究表明，經(jīng)穿膜肽TAT修飾后，GEL基因的表達(dá)效率與GEL單基因相比提高了177倍，但因缺乏腫瘤特異性，故需其他靶向修飾。Low等[13]和Robert[14]改造出VNP20009和A1-R等擁有抑瘤能力的菌株，由于安全性原因，改造菌的抑瘤效果并不顯著，因此，尋找有效的靶向基因和治療基因顯得尤為重要。進(jìn)一步研究顯示，鼠傷寒沙門菌是眾多治療腫瘤細(xì)菌中的理想候選[15]。Ham等[16]將穿膜肽F3與GEL基因構(gòu)建成嵌合肽，對(duì)HeLa、LnCaP、9L和U87 MG癌細(xì)胞進(jìn)行靶向性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在所測(cè)癌細(xì)胞中觀察到F3-GEL表達(dá)量都較高，殺傷作用較強(qiáng)，說(shuō)明GEL基因殺傷力極強(qiáng)，在穿膜肽的協(xié)同作用下，可高效率消滅腫瘤細(xì)胞。

本研究首次構(gòu)建出能夠高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL、LH430/pEGFP-GEL和LH430/pEGFP。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組沙門菌沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)時(shí)間和劑量的依賴性，對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組48h時(shí)抑制效果最佳，IC50值最低。對(duì)于HEK-293細(xì)胞，各重組沙門菌均顯示出較低的殺傷力，且LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組的IC50值最高，說(shuō)明對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更高的靶向性。

本研究結(jié)果中，LH430/pEGFP-N1組對(duì)腫瘤細(xì)胞同樣有殺傷作用，其原因?yàn)橐环矫婕?xì)菌可以通過(guò)其自身的毒力物質(zhì)，如內(nèi)毒素和侵襲素等誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡；另一方面宿主細(xì)胞經(jīng)刺激后可產(chǎn)生如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、凋亡蛋白等作用于自身并引起凋亡[17]。由于減毒沙門菌 LH430 本身便具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，因此，亦可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)因本研究采用重組減毒沙門菌治療，在侵入腫瘤組織后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，使免疫細(xì)胞集中于腫瘤組織，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，與Felgner等[15]的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)的研究結(jié)果證明，重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL靶向效果良好，抑瘤效果明顯，為下一步腫瘤動(dòng)物模型的試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。