張雪,曹利利,郭衍冰,董航,苑淑賢,姚新華,趙權
(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院,吉林 長春 130118;2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院,吉林 長春 130062)
禽白血病(avian leucosis)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)和禽肉瘤病病毒(avian sarcoma virus,ASV)引起的以禽類造血組織中某些細胞增生為主的腫瘤性傳染病的統(tǒng)稱[1]。該病主要通過先天感染和水平接觸感染傳播[2]。感染此病的雞群或者野生禽類會出現(xiàn)發(fā)育不良、抵抗力下降、身體各部位生出腫瘤等癥狀,此病對于全球養(yǎng)禽業(yè)具有一定威脅[3]。該病主要宿主是雞,在肉雞、蛋雞及我國地方品系雞群中均有發(fā)生,死亡率一般為1%~2%,高發(fā)時可達20%。我國已經(jīng)把禽白血病歸類為二類動物疫病[4]。
ALV是直徑約90 nm的C型逆轉錄RNA病毒。根據(jù)gp85蛋白抗原性的差異以及病毒中和、受體結合和交叉干擾等試驗,將ALV分為A、B、C、D、E和J等10個亞群。ALV結構基因編碼區(qū)從5′端到3′的順序為gag-pol-env。其中env基因編碼病毒的2個囊膜蛋白,gp85表面蛋白和gp37跨膜蛋白[5]。gp85編碼ALV受體結合決定簇,通過與宿主細胞表面受體結合,使gp37構象發(fā)生改變,通過gp37編碼的跨膜蛋白定位到細胞膜上最終使病毒與宿主的細胞膜融合[6]。由于gp85的中心區(qū)包含5個可變區(qū)簇,導致其極易發(fā)生突變[7]。因此,gp37中含有的相對保守序列很可能成為抗病毒的重要靶點,而目前我國對該基因的研究很少。為深入了解gp37結構和功能,本研究借助生物信息學的方法對gp37蛋白質的理化性質等進行分析,通過構建重組質粒,誘導gp37的原核表達并純化其蛋白,為后續(xù)制備相應單抗、建立禽白血病診斷方法奠定基礎。
大腸桿菌DH5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài),購自生工生物工程(上海)股份有限公司;pMD18-T質粒、pET-28a(+)載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。
T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ均購自寶生物工程(大連)有限公司;2×TaqPCR MasterMIX,DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒(離心柱型)均購自天根生化科技(北京)有限公司;Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)購自康為世紀;脫脂奶粉購自OXOID,HRP標記兔抗雞二抗購自EARTHOX,DAB顯色試劑盒購自邁新試劑。
依據(jù)ALV-J HPRS-103株的gp37基因序列(GenBank:Z46390)設計合成了1對特異性引物。上游引物(gp37-F):5′-AAAGAGG-ATCCATGTCGCTGAGTCGTCTCTCGCC-3′(斜體為BamHⅠ酶切位點),下游引物(gp37-R):5′-GCGCAAGCTT-TTACAGCTGCTCCCTAATTCTATG-3′(斜體為HindⅢ酶切位點),目的片段大小為591 bp。以ALV JL-2株(本實驗室分離)前病毒cDNA為模板,PCR 擴增gp37基因。具體反應體系:2×TaqPCR MasterMix 10 μL,gp37-F 1 μL,gp37-R 1 μL,DNA 2 μL,ddH2O 6 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。
將回收的PCR產物取5 μL與0.5 μL pMD18-T 質粒、4.5 μL酶溶液Ⅰ置于1.5 mL離心管中連接,4 ℃過夜。轉化至DH5α感受態(tài),構建克隆載體pMD-gp37。應用質粒小提試劑盒(離心柱型)提取質粒,經(jīng)gp37-F/gp37-R為引物及限制性內切酶BamHⅠ/HindⅢ分別進行PCR及雙酶切鑒定并測序。將測序正確的pMD-gp37及pET-28a(+)用BamHⅠ/HindⅢ進行雙酶切,T4 DNA連接酶連接酶切后的目的片段及載體,轉化感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,構建重組表達載體pET-gp37。提取質粒后進行PCR 鑒定和酶切鑒定。
選取13株不同分型禽白血病病毒毒株gp37基因(表1),通過DNAman軟件,經(jīng)BLAST進行進化分析。將測序結果通過生物信息學軟件對該序列的編碼蛋白質的理化性質、信號肽,親/疏水性等進行分析。
表1 13株不同分型禽白血病病毒毒株信息
1.6.1 SDS-PAGE鑒定
分別接種10 μL鑒定為陽性的pET-gp37重組菌及pET-28a(+)對照菌至5 mL含有Kan(30 μg/mL)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。再按照1∶100分別接種至新的100 mL含有 Kan(30 μg/mL)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5~2 h,至OD600達到0.6,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h。分別吸出1 mL置于1.5 mL離心管12 000 r/min離心1 min,棄上清。加入40 μL蒸餾水及10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑混勻。沸水中浴10 min,12 000 r/min離心5 min,進行SDS-PAGE鑒定。另吸出4 mL重組菌,8 000 r/min離心5 min,棄上清,再加入1 mL PBS混勻,冰浴超聲破碎菌體,分離沉淀和上清。取40 μL上清加10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑,混勻;取40 μL蒸餾水及10 μL 5×蛋白上樣緩沖劑加入沉淀,混勻。將上述2管樣品沸水浴中煮10 min,12 000 r/min離心5 min,進行SDS-PAGE鑒定其表達形式。
1.6.2 Western blot鑒定
將誘導表達后pET-gp37重組菌及pET-28a(+)對照菌進行SDS-PAGE鑒定。通過轉膜儀將凝膠中蛋白質轉至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉的緩沖液中封閉。以J型ALV陽性雞血清為一抗,HRP標記兔抗雞為二抗進行孵育。最后應用DAB顯色試劑進行顯色。
將誘導表達的pET-gp37重組菌,8 000 r/min離心5 min,棄上清,加入10 mL結合緩沖液, 冰浴超聲波裂解菌體。12 000 r/min離心10 min,收集上清。應用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶型蛋白)純化后進行SDS-PAGE鑒定。
將PCR擴增產物,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在約591 bp處有1條清晰的條帶,與預期目的條帶大小一致,如圖1。將獲得的gp37目的基因連接至pMD-18-T載體,構建成克隆載體質粒pMD-gp37,通過PCR及雙酶切鑒定,結果如圖2 所示,在約591 bp處均有目的片段條帶。
M.DL2000 DNA Marker;1.目的片段
M.DL2000 DNA Marker;1.PCR鑒定;2.雙酶切;3.pMD-gp37質粒對照
2.2.1 同源性分析
測序結果顯示,ALV JL-2株gp37基因含有591個核苷酸,編碼197個氨基酸。與HPRS-103株通過BLAST進行比對表明,核苷酸序列同源性為98.82%,氨基酸序列同源性為96.95%,二者位于同一進化分支(圖3)。
?本試驗研究毒株
2.2.2 gp37蛋白理化性質分析
應用Prot Param 在線軟件對gp37基因理化性質分析。該蛋白含有197個氨基酸,酸性氨基酸(Asp+Glu)22個,堿性氨基酸(Arg+Lys)20個,分子量22 kDa,等電點pI 6.36,分子式是C989H1572N276O278S14,原子總數(shù)3129。在280 nm處,所有半胱氨酸形成二硫鍵時,消光系數(shù)是23 990 mol/cm(Abs=1 g/L,1.079),所有二硫鍵均打開時,消光系數(shù)是23 490 mol/cm(Abs=1 g/L,1.057)。肽段N末端是 S(Ser)時,估計在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞體外半衰期1.9 h,在酵母體內半衰期>20 h,在大腸桿菌體內半衰期>10 h。不穩(wěn)定指數(shù)43.10,表明該蛋白在溶液中不穩(wěn)定。脂溶性指數(shù)104.06,平均親水指數(shù)0.142。
2.2.3 gp37蛋白信號肽分析
利用SignalP-5.0 對gp37蛋白信號肽進行分析,結果顯示信號肽值是0.015 5,表明無信號肽。
2.2.4 親/疏水性分析
利用ProtScale對gp37蛋白親/疏水性分析,其中正值表示疏水性,值越大疏水性越大,負值表示親水性,值越小親水性越強。1.0~3.0表示高疏水性氨基酸,-3.0~-1.0表示高親水性氨基酸。結果如圖4所示,gp37蛋白有較多個疏水性氨基酸,親/疏水性最小值是-2.067,最大值是3.489。
圖4 親/疏水性分析結果
將構建的原核表達pET-gp37陽性質粒進行PCR及雙酶切鑒定,在591 bp左右出現(xiàn)1條特異性條帶,與預期目的片段大小相符,如圖5。
M.DL2000 DNA Marker;1.pET-28a對照;2.雙酶切鑒定結果;3.PCR鑒定結果
將重組表達菌pET-gp37經(jīng)IPTG誘導表達處理后作SDS-PAGE及Western blot鑒定,均出現(xiàn)與目的蛋白22 kDa大小相符的條帶。蛋白純化后經(jīng)IMAGE J灰度分析,純度為98%,純化的gp37蛋白濃度是2.7 mg/mL,如圖6、圖7。
M.預染蛋白質Marker Ⅲ;1.pET-28a(+)誘導表達產物;2.pET-gp37誘導表達產物;3.純化產物
相對于gp85而言,gp37具有相對保守的基因序列,且其在細胞病毒融合過程中起關鍵作用,因此gp37可作為防治禽白血病相關研發(fā)的另一重要蛋白[8-9]。國內關于gp37蛋白鮮有報道,僅王曉偉等[10]利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對該基因進行了表達。本試驗利用原核表達系統(tǒng)對gp37基因進行表達,并采用生物信息學方法對gp37基因編碼產物進行分析,為揭示gp37基因的特性提供了有價值的理論依據(jù)。
以往有研究表明,蛋白質的半衰期與其穩(wěn)定性相關,即半衰期長則穩(wěn)定性高[11]。本研究結果顯示,gp37半衰期不長,屬于不穩(wěn)定蛋白,且含有多個疏水性氨基酸,無信號肽屬非分泌蛋白,而這些特性與其功能的發(fā)揮是否存在某種聯(lián)系,值得后續(xù)研究。
大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前重組蛋白表達與純化最常用系統(tǒng),擁有眾多不同類型的載體,與其他表達系統(tǒng)相比具有遺傳背景清晰、生長迅速、培養(yǎng)成本低、表達量高等諸多優(yōu)點,至今已發(fā)展成為一種安全的基因工程實驗體系,廣泛應用于疫苗生產和蛋白質功能等方面的研究[12]。本研究對gp37基因進行原核表達,得到帶有His標簽的融合蛋白,為進一步分析gp37結構和功能,制備gp37蛋白的抗體,建立新的ALV檢測方法等后續(xù)研究提供了參考。