史志斌，馬寧寧，劉占，王永生，陳陸

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院動(dòng)物傳染病教研室，河南 鄭州 450046)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科[1]，引起的豬偽狂犬病(porcine pseudorabies)嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)[2]。豬急性感染PRV后引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及木乃伊胎、種豬不育、新生仔豬腦脊髓炎等[3-4]。急性感染耐過豬和隱性感染豬能建立終生潛伏感染，潛伏的病毒存在于三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和扁桃體等組織，在應(yīng)激狀態(tài)下活化并向外排毒，因此，潛伏感染豬是偽狂犬病潛在傳染源[5-7]。PRV潛伏感染特性給豬偽狂犬病的防控帶來巨大困難。目前，防控本病主要依靠疫苗免疫，生產(chǎn)中常用的偽狂犬病疫苗主要是PRV毒力基因(如TK、gE、gI等)或糖蛋白基因(如gC、gG等)缺失的基因工程苗[8]，尤其以TK和gE基因的缺失最為重要。gE基因缺失可降低PRV神經(jīng)嗜性，也可作為診斷標(biāo)志，通過對(duì)gE糖蛋白誘導(dǎo)抗體的血清學(xué)檢測鑒別疫苗免疫豬和野毒感染帶毒豬，為偽狂犬病的凈化提供技術(shù)支持[9-11]。2012年始，偽狂犬病在我國傳統(tǒng)疫苗免疫場再次出現(xiàn)暴發(fā)和流行，新出現(xiàn)的流行株表現(xiàn)毒力增強(qiáng)。為了研發(fā)針對(duì)當(dāng)前流行株的疫苗，本文首先從實(shí)驗(yàn)室分離的4株P(guān)RV流行株篩選高免疫原性親本株，然后利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre/loxP系統(tǒng)對(duì)親本株gE基因進(jìn)行缺失，并對(duì)構(gòu)建的gE基因缺失株制備的滅活疫苗的免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，為偽狂犬病標(biāo)志疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

EcoRⅠ、SpeⅠ、HindⅢ、BbsⅠ和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司；2×DMEM高糖培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 病毒和細(xì)胞

PRVHNQYY2012株、HNQXX2012株、HNQXY2012株、HNQBA2012株，Vero和293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 質(zhì)粒

pMD18-T載體購自TaKaRa公司；pX330和DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcGlobin2-Cre質(zhì)粒購自上海權(quán)陽生物科技有限公司；pEGFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室合成保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡昆明小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.5 方法

1.5.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的PRV基因序列(登錄號(hào)：KP722022.1)，使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)gE基因上下游同源臂的擴(kuò)增引物。利用http://crispr.mit.Edu設(shè)計(jì)靶向PRV gE基因的單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA，sgRNA)。序列信息見表1。

表1 引物及sgRNA序列信息

1.5.2 PRV親本株篩選

將HNQYY2012株、HNQXX2012株、HNQXY2012株、HNQBA2012株稀釋至104TCID50/0.1 mL后滅活，病毒液和Montanide ISA 201 VG佐劑按體積比1∶1比例混合乳化，制成豬偽狂犬病滅活疫苗。25只昆明小鼠隨機(jī)均分5組，1～4組分別皮下注射不同毒株制備的滅活疫苗，200 μL/只(104TCID50/只)，最后1組注射DMEM培養(yǎng)基200 μL/只作對(duì)照。一免2周后進(jìn)行二次免疫，一免2周、二免2周和二免4周時(shí)分別采血并測定中和抗體效價(jià)，選擇抗體水平高、免疫原性好的毒株用于構(gòu)建gE基因缺失株。

1.5.3 病毒基因組提取

HNQYY2012株接毒于Vero細(xì)胞，待細(xì)胞病變80%時(shí)收毒。酚氯仿法抽提病毒DNA后溶于TE，-20 ℃保存。

1.5.4 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

以HNQYY2012株基因組為模板，利用引物gEL-f/gEL-r和gER-f/gER-r分別擴(kuò)增gE基因上、下游同源臂gEL和gER。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。gEL和gER分別用EcoRⅠ/SpeⅠ和SpeⅠ/HindⅢ雙酶切，純化后克隆到EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切的pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒pTgE。pEGFP質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ/SpeⅠ雙酶切后，純化獲得EGFP片段并克隆到pTgE質(zhì)粒上，得到重組載體pTgE-EGFP。

靶向PRV gE基因的sgRNA退火成雙鏈，將pX330質(zhì)粒用BbsⅠ酶切，形成黏性末端，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，雙鏈sgRNA與pX330質(zhì)粒連接構(gòu)成質(zhì)粒pX330-sgRNA。

1.5.5 HNQYY2012ΔgE/EGFP+的獲得和純化

利用Lipofectamine?2000 Reagent轉(zhuǎn)染。將HNQYY2012基因組、pX330-sgRNA和pTgE-EGFP按質(zhì)量比1∶1∶2混于250 μL Opti-MEM，獲得溶液A；250 μL Opti-MEM加入10 μL Lipofectamine?2000混勻，獲得溶液B；溶液A和B輕緩混勻，室溫靜置20 min后緩慢滴加到293T細(xì)胞，36 h后-80 ℃凍融2次備用。處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液(含細(xì)胞碎片)8 000 r/min離心5 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌并接種Vero細(xì)胞，PRV的基因組感染特性導(dǎo)致Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變，達(dá)到70%時(shí)收獲病毒，蝕斑純化法挑取帶綠色熒光空斑得到純化病毒，命名為HNQYY2012ΔgE/EGFP+。

1.5.6 HNQYY2012ΔgE株的獲得與純化

共轉(zhuǎn)染HNQYY2012ΔgE/EGFP+基因組和pcGlobin2-Cre質(zhì)粒到293T細(xì)胞內(nèi)，pcGlobin2-Cre質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)生的Cre酶識(shí)別HNQYY2012ΔgE/EGFP+基因組EGFP基因兩端同向的Loxp序列實(shí)現(xiàn)EGFP基因的敲除。參照1.5.5方法獲得含HNQYY2012ΔgE基因組的上清液并接種Vero細(xì)胞。蝕斑純化直至所有細(xì)胞病變均不帶熒光時(shí)獲得HNQYY2012ΔgE株。

1.5.7 HNQYY2012ΔgE株的PCR鑒定

酚氯仿法抽提HNQYY2012ΔgE病毒基因組，用引物gEL-f和gER-r進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.5.8 HNQYY2012株親本株與ΔgE株一步生長曲線

HNQYY2012親本株和HNQYY2012ΔgE以MOI=0.5接種Vero細(xì)胞，接毒后12、24、36、48、60、72 h收獲病毒，測定TCID50并繪制一步生長曲線。

1.5.9 HNQYY2012ΔgE株LD50測定

35只昆明鼠隨機(jī)均分成7組，1～3組分別皮下注射102、103和104的TCID50的PRV親本毒，4～6組分別皮下注射102、103和104的TCID50的HNQYY2012ΔgE，第7組為DMEM的對(duì)照組。觀察1周，Karber法計(jì)算LD50。

1.5.10 豬偽狂犬病滅活疫苗(HNQYY2012ΔgE株)的制備和免疫效力試驗(yàn)

HNQYY2012ΔgE株用Vero細(xì)胞增殖并定量為2×106TCID50/0.1 mL。0.3%的甲醛滅活后與Montanide ISA 201 VG佐劑按體積比1∶1乳化，制備成滅活疫苗。30只昆明鼠隨機(jī)均分成6組，1～3組免疫滅活疫苗0.1 mL/只，4～6組為不做免疫的對(duì)照組。1～3組二免二周后和對(duì)照4～6組分別以5LD50、10LD50和20LD503種劑量攻毒，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 20.0對(duì)所得統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用新復(fù)極差法(SSR)，設(shè)置顯著性水平為0.05。最后用作圖軟件GraphPad Prism 6進(jìn)行制圖，數(shù)據(jù)表示的形式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV親本株篩選

如圖1所示，在一免2周時(shí)4種毒株中和抗體水平均顯著高于DMEM培養(yǎng)基對(duì)照組(P<0.05)，但4種毒株之間差異不顯著(P>0.05)；在二免2周和二免4周時(shí)HNQYY2012和HNQXY2012株在抗體水平上相比其他毒株明顯升高(P<0.05)。HNQYY2012株優(yōu)于HNQXY2012株，因此選擇HNQYY2012株為親本株構(gòu)建PRV gE基因缺失株。

同一處理內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.2 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

以pTgE為對(duì)照，用引物gEL-f/gER-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pTgE-EGFP擴(kuò)增產(chǎn)物長度大于對(duì)照組(圖2)，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明擴(kuò)增的條帶包括gE上游同源臂、EGFP序列和gE下游同源臂，證明成功構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pTgE-EGFP。pX330-sgRNA進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后呈單一條帶，未連接的PX330空載體酶切后出現(xiàn)2個(gè)條帶(圖3)，證明成功構(gòu)建了pX330-sgRNA質(zhì)粒。

M.15 000 bp DNA Marker；1.pTgE；2.pTgE-EGFP

M.15 000 bp DNA Marker；1.pX330-sgRNA的EcoRⅠ和BbsⅠ雙酶切；2.pX330的EcoRⅠ和BbsⅠ雙酶切

2.3 重組病毒HNQYY2012ΔgE的獲得與純化

pX330-sgRNA作用下，HNQYY2012基因組和pTgE在293T細(xì)胞內(nèi)發(fā)生重組，收獲樣品后接種Vero細(xì)胞，72 h后出現(xiàn)明顯帶綠色熒光的細(xì)胞病變，說明有重組病毒產(chǎn)生。經(jīng)過7輪噬斑純化，得到重組病毒HNQYY2012ΔgE/EGFP+(圖4)。在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增HNQYY2012 ΔgE/EGFP+并提取基因組，以相同方法將HNQYY2012ΔgE/EGFP+基因組和pcGlobin2-Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得重組病毒HNQYY2012ΔgE基因組后再次接種Vero細(xì)胞，72 h后出現(xiàn)不帶綠色熒光的細(xì)胞病變。相同方法純化后獲得純度較高的重組病毒HNQYY2012 ΔgE。

A.HNQYY2012ΔgE/EGFP+重組病毒接種Vero細(xì)胞；B.HNQYY2012ΔgE/EGFP+重組病毒接種Vero細(xì)胞；C.正常Vero細(xì)胞對(duì)照

以重組病毒HNQYY2012ΔgE和HNQYY2012ΔgE/EGFP+基因組為模板，用引物gEL-f/gER-r擴(kuò)增gE基因。重組病毒HNQYY2012ΔgE/EGFP+擴(kuò)增之后在4 400 bp的位置出現(xiàn)條帶，而重組病毒HNQYY2012ΔgE在2 600 bp的位置出現(xiàn)條帶(圖5)。對(duì)重組病毒HNQYY2012ΔgE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明HNQYY2012ΔgE重組病毒gE基因完全缺失。

M.250 bp DNA Marker；1.空白對(duì)照組；2.gEL-f/gER-r對(duì)HNQYY2012ΔgE的PCR擴(kuò)增；3.gEL-f/gER-r對(duì)HNQYY2012ΔgE/EGFP+的PCR擴(kuò)增

2.4 HNQYY2012ΔgE和親本毒一步生長曲線的測定

由圖6可知HNQYY2012ΔgE和親本毒的最高滴度分別為106.8TCID50/0.1 mL和107.0TCID50/0.1 mL，差異不顯著(P>0.05)，HNQYY2012ΔgE的病毒滴度和親本毒差異不大。在24、36、60 h時(shí)間點(diǎn)，親本毒滴度極顯著高于HNQYY2012ΔgE(P<0.01或P<0.001)，說明gE基因缺失對(duì)PRV的滴度和增殖速度影響較小。

**P<0.01，***P<0.001

2.5 HNQYY2012ΔgE和親本毒LD50測定

測定HNQYY2012ΔgE和親本毒LD50分別為103.8TCID50和102.5TCID50，差異顯著(P<0.05)，說明gE基因缺失后PRV的毒力有一定程度下降。

2.6 滅活疫苗(HNQYY201ΔgE株)的免疫效力試驗(yàn)

滅活疫苗(HNQYY2012ΔgE株)免疫小鼠對(duì)5LD50、10LD50劑量攻毒保護(hù)率均為100%，20LD50的攻毒劑量組有1只小鼠存活，保護(hù)率為20%，3組對(duì)照組保護(hù)率均為0。結(jié)果表明豬偽狂犬病HNQYY2012 gE基因缺失株滅活疫苗具有良好免疫效力。小鼠生存曲線如圖7所示。

圖7 HNQYY2012ΔgE滅活疫苗免疫小鼠攻毒后生存曲線

3 討論

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是從細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)展演變而來，可以對(duì)靶基因進(jìn)行敲除和突變，其技術(shù)成熟，成本較低，在活體動(dòng)物、細(xì)胞和病毒中都有廣泛的應(yīng)用[12-14]。徐廣軍等[15]利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了GTP蛋白酶M(IRGNs)基因缺失的MDCK細(xì)胞系。IRGNs是由干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的，在抵御病原微生物中發(fā)揮著核心的作用。通過敲除MDCK細(xì)胞的IRGMs，可以進(jìn)一步研究IRGMs基因在細(xì)胞內(nèi)抵御病原微生物感染中的作用。吳濤等[16]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)腸道病毒71型(EV71)的VP4區(qū)域進(jìn)行了剪切，從而抑制了EV71病毒的復(fù)制，為治療EV71提供了新的途徑。Whitworth等[17]利用CRISPR-Cas9技術(shù)分別敲除了豬的CD163和CD1D基因，這2個(gè)基因被認(rèn)為是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的受體基因和抗原遞呈因子，通過敲除這2個(gè)基因后，豬體對(duì)PRRSV具有良好的抗病能力，證明CRISPR-Cas9可以成功地應(yīng)用到動(dòng)物疫病防控策略中。Cre-loxp系統(tǒng)也常被用于進(jìn)行病毒基因組重組的系統(tǒng)。梁苑燕等[18]首先構(gòu)建出了帶有l(wèi)oxp位點(diǎn)和EGFP的PRV gE-/EGFP+株，之后通過Cre酶處理后，得到了不帶EGFP的PRV gE-株，之后又利用同樣的方法得到了PRV gE-/TK-株。Xu等[19]利用CRISPR-Cas9和Cre-loxp系統(tǒng)同時(shí)對(duì)PRV的gE/TK基因進(jìn)行缺失，成功構(gòu)建了PRV gE-/TK-株。本試驗(yàn)利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre-loxp系統(tǒng)對(duì)PRV gE基因進(jìn)行缺失，經(jīng)過PCR和測序鑒定，證明gE基因得到完全缺失。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用CRISPR-Cas9技術(shù)和Cre-loxp系統(tǒng)進(jìn)行病毒的基因缺失是可行且高效的，同時(shí)以2012年后新出現(xiàn)的高免疫原性PRV流行株為親本株構(gòu)建的gE基因缺失株并制備滅活疫苗更符合市場需求。

HNQYY2012ΔgE株和親本株的一步生長曲線結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，兩者的增殖最高滴度差異不顯著，但gE基因的缺失導(dǎo)致PRV在細(xì)胞上的增殖速度減緩。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)HN1201株感染PK-15細(xì)胞后病毒增殖速度減緩卻可以達(dá)到相近的病毒滴度，病毒蝕斑變小，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。HNQYY2012ΔgE毒力和親本毒相比差異顯著，半數(shù)致死量高于親本毒表明gE基因缺失后PRV毒力下降。gE基因是PRV的主要毒力基因，在病毒的復(fù)制及病毒在細(xì)胞間的傳播過程中起到關(guān)鍵的作用。研究證明gE基因缺失后，PRV的毒力明顯的降低[20]。將HNQYY2012ΔgE株制備滅活疫苗，并在昆明鼠上進(jìn)行了免疫效力試驗(yàn)，結(jié)果表明，免疫滅活疫苗后，小鼠可以抵御105TCID50劑量的親本毒的攻擊，而對(duì)106TCID50劑量攻毒后的保護(hù)率明顯降低。結(jié)果證明所制備的滅活疫苗可以對(duì)小鼠產(chǎn)生有效的保護(hù)。HNQYY2012ΔgE株滅活疫苗免疫動(dòng)物，取得的血清中不含gE抗體，可用于鑒別疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物，故本試驗(yàn)獲得的毒株可作為PRV的候選疫苗株使用。