苗珍，李席席，高曉建，張雙明，姜姿妍，陳啟運(yùn)，童帥旗，張曉君

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹(以下簡(jiǎn)稱河蟹)，也稱大閘蟹，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目，是一種在淡水中生長(zhǎng)育肥、在海水中生殖繁衍的洄游性甲殼類動(dòng)物。其營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，被譽(yù)為水產(chǎn)珍品，深受廣大消費(fèi)者的青睞。隨著20世紀(jì)80年代河蟹人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)的突破，其養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖面積在逐漸擴(kuò)大，2016年我國(guó)成蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)81.21萬(wàn)噸[1]。然而在河蟹大量養(yǎng)殖過(guò)程中也伴隨了一些病害的發(fā)生，尤其是由某些病原微生物特別是細(xì)菌引起的傳染病，常具有發(fā)病及死亡率高、在特定水環(huán)境中傳播速度快等特點(diǎn)，已成為制約其發(fā)展的不利因素之一。徐海圣等[2]從患病河蟹分離到致病菌副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)；姜光明等[3]從患病河蟹體內(nèi)分離到致病菌維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)；曹海鵬等[4]從患腸炎的河蟹體內(nèi)分離到點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonaspunctate)；徐海圣等[5]從患病河蟹體內(nèi)分離到易損氣單胞菌(Aeromonastrota)。2017至2018年課題組對(duì)江蘇省揚(yáng)州多家河蟹養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)病池塘河蟹大量死亡，不攝食、行動(dòng)緩慢，活力下降，附肢無(wú)力，應(yīng)激能力減弱，個(gè)別出現(xiàn)在池塘周邊；病蟹體色較健康蟹灰暗，無(wú)光澤，病原檢測(cè)結(jié)果表明引起多家養(yǎng)殖場(chǎng)河蟹大批死亡的病原之一為弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。該菌是一種“人-獸-魚”共染病原菌，可引起人、哺乳動(dòng)物、魚、鱉、蝦等感染發(fā)病[6]。目前已有研究表明弗氏檸檬酸桿菌對(duì)紅螯螯蝦、中華絨螯蟹、三疣梭子蟹、中華鱉和克氏原螯蝦等多種水產(chǎn)動(dòng)物具有致病性[7-10]。此外，F(xiàn)ernandez等[11]報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌可導(dǎo)致新生劍吻鯨死亡。

本研究對(duì)分離自病蟹體內(nèi)的菌株LJ1進(jìn)行了形態(tài)特征、理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列的同源性分析及致病性檢驗(yàn)，確定該病原為致病性弗氏檸檬酸桿菌，該病原菌對(duì)河蟹的半數(shù)致死量(LD50)為2.1×106CFU/mL，且攜帶7種毒力基因，旨在為中華絨螯蟹病原學(xué)研究積累相關(guān)資料，為其相關(guān)疾病的防控提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離與純培養(yǎng)

從江都某養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)取6只病蟹用生理鹽水多次洗滌后取肝胰腺以及肌肉劃線到LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。選取優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌落進(jìn)一步劃線純化，將純化后的細(xì)菌接種到普通液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，之后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 人工感染試驗(yàn)

對(duì)分離菌株LJ1進(jìn)行人工感染試驗(yàn)以確定其致病性。試驗(yàn)用體長(zhǎng)4 cm左右健康幼蟹，購(gòu)自江蘇省金壇一河蟹養(yǎng)殖場(chǎng)。將菌株LJ1接種于普通LB液體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀用0.85% NaCl生理鹽水重懸，再次離心、重懸后，用生理鹽水將菌液制備成2.7×108、2.7×107、2.7×106、2.7×105、2.7×104CFU/mL共5個(gè)濃度梯度，分別用不同濃度的供試菌懸液對(duì)健康的幼蟹進(jìn)行肌肉注射感染，每個(gè)試驗(yàn)組10只，每只注射0.1 mL；注射相同劑量的生理鹽水作對(duì)照。對(duì)感染后的幼蟹隔離培養(yǎng)，定時(shí)觀察并記錄河蟹的死亡情況，測(cè)定分離菌對(duì)河蟹的LD50[12]。

1.3 形態(tài)與理化特性檢驗(yàn)

將上述純培養(yǎng)菌株分別接種于普通LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的表型特征，同時(shí)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征，分離菌LJ1經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察鞭毛等形態(tài)。依據(jù)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行糖(醇和苷)類代謝、有機(jī)酸鹽利用、硝酸鹽還原等理化特性測(cè)定。

1.4 16S rRNA和gyrB基因序列測(cè)定與同源性分析

1.4.1 PCR模板DNA的制備

將菌株接種于普通液體培養(yǎng)基中，置于搖床中28 ℃培養(yǎng)18 h。取2 mL的菌液12 000 r/min離心1 min；棄上清液，將菌體懸浮于100 μL無(wú)菌生理鹽水中，100 ℃煮沸10 min；冰浴后12 000 r/min離心10 min；取上清液作為PCR模板。

1.4.2 16S rRNA和gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

16S rRNA和gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增方法參文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，利用生工生物工程(上海)有限公司的DNA快速純化試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收純化，純化產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

1.4.3 16S rRNA和gyrB基因序列同源性分析

通過(guò)NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對(duì)分離菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列進(jìn)行序列同源性分析，并使用Clusta1X 2.0軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并對(duì)16S rRNA和gyrB基因采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，采用鄰接建樹方法，并通過(guò)Bootstrap法(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)。

1.5 毒力基因檢測(cè)

為了進(jìn)一步分析菌株LJ1的致病性，篩選了定居因子(cfa)、尿素酶(ureG、ureF、ureE、ureD)、Vi抗原(viaB)、外膜蛋白(ompX)共7個(gè)毒力相關(guān)基因。采用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)弗氏檸檬酸桿菌全基因組序列(GenBank CP016762)設(shè)計(jì)特異性引物，引物見表1。

表1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物引物

PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×PowerTaqPCR MasterMix(南京諾唯贊生物科技有限公司提供)10 μL，正反引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1 μL(29.81 ng/μL)，無(wú)菌雙蒸水8 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌致病性及LD50

供試菌株(LJ1)每組肌肉注射感染健康河蟹幼蟹10尾，供試幼蟹死亡情況見表2。感染后幼蟹表現(xiàn)出活力下降，行動(dòng)遲緩，對(duì)外界刺激反應(yīng)慢等癥狀，分離菌LJ1對(duì)中華絨螯蟹的LD50為2.1× l06CFU/mL。從人工感染后的病蟹體內(nèi)再次分離到病原菌，經(jīng)鑒定與原感染菌株在菌落形態(tài)、生理生化特性等方面均一致，試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌LJ1為本次引起中華絨螯蟹大量死亡的病原菌，且具有較強(qiáng)的致病性。

表2 分離菌LJ1對(duì)中華絨螯蟹的致病性(n=10)

2.2 分離菌表型特征

菌株LJ1在LB培養(yǎng)基上菌落特征為表面濕潤(rùn)光滑、中央隆起、邊緣整齊的淡黃色菌落，培養(yǎng)24 h觀察直徑多在2 mm左右。革蘭染色后觀察，菌體為革蘭陰性、短桿狀、兩端鈍圓、無(wú)芽胞及莢膜，多呈散在分布，大小為0.5～0.8 μm×0.5～1.0 μm。菌株LJ1經(jīng)透射電子顯微鏡觀察顯示，該細(xì)菌為周生鞭毛(圖1)。其他理化特性見表3。綜合分離菌株LJ1理化特性，與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)最接近。

圖1 分離菌LJ1電鏡下形態(tài)

表3 分離菌株的生理生化特性

2.3 16S rRNA和gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

分離菌LJ1所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 408 bp(GenBank登錄號(hào)：MK421413)；所擴(kuò)增的gyrB基因序列長(zhǎng)度為1 168 bp(GenBank登錄號(hào)：MK928323)。

將LJ1的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明與檸檬酸桿菌屬細(xì)菌的相似性在99%以上。16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析顯示，LJ1與弗氏檸檬酸桿菌(登錄號(hào)為KR698931、MF254749、MF716687)聚為一分支，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。gyrB基因同源性分析結(jié)果顯示，LJ1與弗氏檸檬酸桿菌的同源性最高，且與弗氏檸檬酸桿菌(GenBank登錄號(hào)為AY743920)的同源性在99%以上，結(jié)果如圖3所示。

?本試驗(yàn)分離菌株

?本試驗(yàn)分離菌株

2.4 弗氏檸檬酸桿菌毒力基因檢測(cè)

經(jīng)PCR檢測(cè)，菌株LJ1可以擴(kuò)增出cfa、ureG、ureF、ureE、ureD、viaB和ompX等7個(gè)毒力相關(guān)基因(圖4)。

M.DL2000 DNAmarker; 1.cfa(345 bp); 2.ureG(119 bp); 3.ureF(300 bp); 4.ureE(215 bp)、5.ureD(243 bp)；6.viaB(516 bp)；7.ompX(287 bp)

3 討論

弗氏檸檬酸桿菌為革蘭陰性菌，需氧或兼性厭氧，廣泛分布于自然界，土壤、水體、食物都有其分布，此外在哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物等體內(nèi)也可分離。人類可因弗氏檸檬酸桿菌感染而發(fā)生腹瀉、食物中毒、腦膜炎、腦膿腫、敗血癥等。近年來(lái)，關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物患病的報(bào)道不斷增加，該菌可以導(dǎo)致羅非魚、中華鱉、克氏原螯蝦等患病，并造成大量死亡[15-16]。本研究對(duì)揚(yáng)州市江都地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)患病的河蟹進(jìn)行病原學(xué)研究，從瀕死的河蟹肝胰腺、肌肉等病變組織分離大量?jī)?yōu)勢(shì)生長(zhǎng)細(xì)菌，并作純化培養(yǎng)，通過(guò)理化特性和分子鑒定表明分離菌為弗氏檸檬酸桿菌。人工回感試驗(yàn)證實(shí)分離菌對(duì)健康梭子蟹具有較強(qiáng)的致病性, 而且從被感染死亡的河蟹體內(nèi)可回收到單一的原感染菌，由此證實(shí)引發(fā)此次河蟹暴發(fā)性疾病的病原是弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌是一種存在水環(huán)境中的條件致病菌，但由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化，弗氏檸檬酸桿菌一旦侵入養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)，便大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒力因子，導(dǎo)致疾病的暴發(fā)。弗氏檸檬酸桿菌的毒力因子主要包括黏附素、腸毒素、內(nèi)毒素等[17-18]。其中定居因子是弗氏檸檬酸桿菌重要的黏附素，已有研究表明，當(dāng)病原菌感染宿主時(shí)，主要靠細(xì)菌自身定居因子抗原黏附于腸道細(xì)胞，經(jīng)過(guò)定居、繁殖產(chǎn)生腸毒素而引發(fā)宿主死亡[19]。尿素酶也是弗氏檸檬酸桿菌另外一種重要的黏附素，通過(guò)尿素酶分解尿素，在菌體周圍形成氨云以抵御酸性外環(huán)境對(duì)菌體的損傷，使該菌順利在宿主體內(nèi)黏附定殖下來(lái)[20-21]。外膜蛋白OmpX是腸桿菌科細(xì)菌的一種重要毒力因子，OmpX屬于具有毒力特性的蛋白家族，有研究發(fā)現(xiàn)，OmpX參與細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附侵襲以及對(duì)抗宿主免疫防御的過(guò)程，在細(xì)菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、附著等方面有重要作用[22]。Vi抗原是細(xì)菌重要的毒力因子，有研究表明，該致病因子在宿主體內(nèi)存活以及逃避宿主體內(nèi)各種防御機(jī)制中起著廣泛作用[23]。因此，本研究對(duì)分離鑒定的弗氏檸檬酸桿菌在致病過(guò)程中起著重要作用的毒力因子包括cfa、ureG、ureF、ureE、ureD、viaB和ompX進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明LJ1菌株攜帶上述這7個(gè)毒力相關(guān)基因，說(shuō)明強(qiáng)致病性可能與這些毒力相關(guān)基因有關(guān)。本試驗(yàn)為后續(xù)開展河蟹相關(guān)疾病防控研究奠定了基礎(chǔ)。