張典剛， 王曉青， 王若崢

(1新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療中心， 烏魯木齊 830011； 2新疆腫瘤學重點實驗室， 烏魯木齊 830011；13中國醫(yī)學科學院腫瘤免疫與放療研究重點實驗室， 烏魯木齊 830011； 4新疆伊犁州友誼醫(yī)院放療科， 新疆 伊犁 835000)

免疫治療(immunotherapy, IT)是目前腫瘤治療的研究熱點，在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。目前研究較多的免疫檢查點(immune checkpoints, IC)有抗程序性死亡受體-1(Programmed Death-1, PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4, CTLA-4)和T細胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain containing molecule-3, Tim-3)，PD-1、CTLA-4等免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICI)已批準上市，但其療效尚不滿意，同時免疫相關不良反應如免疫相關性腎炎、肺炎、腸炎也令人擔憂[1-2]。BTLA是繼PD-1、CTLA-4之后發(fā)現(xiàn)的CD28超家族中第3個免疫檢查點，也是T細胞表面的負性共刺激分子[3]。有研究發(fā)現(xiàn)敲除BTLA的小鼠體內(nèi)T細胞的功能顯著增強，從而提示BTLA過表達與T細胞功能耗竭有關[4]。本實驗收集CSCC癌患者的外周血和配對的癌組織，采用流式細胞檢測技術獲得T細胞上BTLA的表達量，并結(jié)合臨床資料及近期療效進一步分析，為宮頸癌新的免疫治療靶點的發(fā)現(xiàn)提供實驗室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2017年1-10月收治的初治宮頸鱗癌患者，根據(jù)納入標準和排除標準共收集45例完整病例資料患者，有明確的病理明確診斷，依據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標準，臨床分期為IIb-IVa期)，床特征見表1。

1.2 隨訪方式主要通過門診或住院復查，隨訪內(nèi)容包括婦科檢查、血液學及影像學檢查評估近期療效。共隨訪35例患者，隨訪截止時間為2018年4月，主要的研究終點為近期療效。

1.3 治療方法

1.3.1 放療的實施 采用外照射和內(nèi)照射，其中體外照射采用調(diào)強技術，內(nèi)照射采用銥192放療。體外照射DT45-50Gy，銥192DT6Gy/f，共5～7f。遵循ICRU50及62號文件的規(guī)定進行靶區(qū)勾畫。腫瘤區(qū)(general tumor volume, GTV)肉眼和影像學所見大體病灶；臨床靶區(qū)(clinical target volume, CTV)宮旁組織、陰道和子宮體；預防淋巴引流區(qū)，包括下腹部淋巴引流區(qū)，閉孔及骶前，髂總及髂內(nèi)、外；陰道旁和韌帶前1/3(IIIa期應考慮預防照射腹股溝淋巴引流區(qū)，IIIb期應考慮預防照射腹主動脈旁淋巴引流區(qū))，計劃靶區(qū)(planning target volume, PTV)在CTV基礎上外放3 mm。計劃及評估：TPS計劃系統(tǒng)。要求95%PTV被處方劑量覆蓋。

表1 宮頸鱗癌患者一般資料

1.3.2 同步化療的實施 放療中同步給予順鉑40 mg/m2靜脈滴注，每周1次，共化療4～6個周期；或者紫杉醇(TAX)135 mg/m2，d1聯(lián)合順鉑20 mg/m2，d1～3，靜脈滴注，3～4周為1周期。

1.4 實驗方法采集治療前肘靜脈血標本15 mL，用EDTA抗凝采血管分裝。活檢鉗夾取治療前宮頸癌組織約0.5 cm3(注意動作輕柔，不要取到出血或炎癥部位而導致結(jié)果有偏差)，使用含有培養(yǎng)基的C管保存。采血后4 h內(nèi)對血液學標本進行外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)的分離，在臺式低溫離心機中操作，將分離好的PBMCs層收集到15 mL離心管中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基至15 mL洗滌細胞，采用自動細胞計數(shù)儀細胞計數(shù)，再用RPMI-1640配置細胞至所需濃度(4×106/mL)供后續(xù)實驗。收集組織后12 h內(nèi)分離腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)。取0.5 M PBMCs和1.0 M TILs，重懸在80 μL FACS洗滌液中，各取2 μL CD4-FITC、CD3-AF700、BTLA-APC-A、CD8-APC-H7標記的抗體加入其中，4℃避光孵育20 min，用FACS洗滌液洗滌2次，加入400 μL固定液，運用BD LSRFortessa流式細胞儀進行檢測，應用Flowjo 10流式數(shù)據(jù)分析軟件分析BTLA在T細胞上的表達量。 Flowjo 10 流式數(shù)據(jù)分析過程見圖1、圖2。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，GraphPad Prism 7.0繪制統(tǒng)計圖。BTLA在外周血和癌組織中T細胞上的表達量呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)(25%，75%)描述。BTLA在外周血和CSCC組織CD4+、CD8+T細胞表達量之間的比較應用配對秩和檢驗和Spearman秩相關分析， BTLA在外周血和CSCC組織CD4+、CD8+T細胞表達量與臨床特征的比較應用兩獨立樣本秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BTLA在外周血和癌組織中T細胞上的表達CSCC外周血和組織中BTLA在CD4+T細胞上的表達量分別為60.60(37.75，68.20)%、0.57(0.18，1.44)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖3。Spearman秩相關分析，相關系數(shù)r=0.250，P=0.097，二者無相關性。CSCC外周血和組織中BTLA在CD8+T細胞上的表達量分別為32.20(27.05，35.55)%、1.04(0.26,4.48)%，配對秩和檢驗分析，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖3。Spearman秩相關分析，相關系數(shù)r=0.253，P=0.094，二者無相關性。

2.2 BTLA在外周血中T細胞上的表達與臨床特征的比較CSCC BTLACD8+T細胞的表達量在菜花型、結(jié)節(jié)型、其他類型分別為25.60(16.60，31.40)%、33.40(30.30，36.03)%、32.20(31.00，35.80)%，其不同腫瘤大體類型的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)，見表2。

圖1 局部晚期宮頸鱗癌患者外周血中CD4+、CD8+T細胞上BTLA的表達分析策略

圖2 局部晚期宮頸鱗癌患者癌組織中CD4+、CD8+T細胞上BTLA的表達分析策略

圖3 局部晚期宮頸鱗癌患者外周血和癌組織中CD4+、CD8+T細胞上BTLA的表達情況

表2 宮頸癌患者外周血中T細胞上BTLA的表達與臨床特征的比較

2.3 BTLA在癌組織中T細胞上的表達與臨床特征的比較CSCC病理類型低分化和中分化患者癌組織中BTLACD8+T、CD4+T細胞上的表達量分別為2.99%、0.72%和7.04%、0.54，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。CSCC有無惡性腫瘤家族史的患者癌組織中CD4+T、CD8+T細胞上BTLA的表達量7.04、0.54和6.96、0.99，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.045、P=0.012)。見表3。CSCC患者CR+PR為97.14%，外周血和癌組織中T細胞BTLA表達水平CR組與PR+SD差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

免疫檢查點BTLA主要表達于B、T淋巴細胞表面，BTLA在T細胞活化過程中起負性調(diào)節(jié)作用，可與PD-1、CTLA-4等協(xié)同抑制T細胞的增殖和細胞因子產(chǎn)生，是T細胞功能耗竭的免疫檢查點之一。Ritthipicha等[5]研究發(fā)現(xiàn)BTLA能向激活的CD8+T細胞提供共抑制信號。Forget等[6]發(fā)現(xiàn)BTLA和CTLA-4在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的癌組織中均表達較低，而在TIL過繼細胞療法中，從患者惡性腫瘤組織中提取出浸潤淋巴細胞，在體外擴增這些免疫細胞后輸回患者體內(nèi)，其療效與CTLA-4+BTLA+CD8+T細胞表達量相關，故轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者運用TIL過繼細胞療法療效不理想，本研究也發(fā)現(xiàn)BTLA在癌組織中的表達較低。Li等[7]收集了肝癌、宮頸癌、乳腺癌、宮頸癌、腎癌等8種常見惡性腫瘤的外周血與癌組織，通過流式細胞技術檢測了PD-1、CTLA-4、Tim-3、BTLA等免疫檢查點的表達，發(fā)現(xiàn)BTLA在上述惡性腫瘤患者癌組織的表達均低于外周血，并且BTLA 在CD4+T細胞中外周血表達量最高。本研究結(jié)果顯示癌組織中BTLAT細胞亞群明顯低于外周血，靜脈使用BTLA免疫檢查點抑制劑可能會導致較明顯的免疫相關不良反應，提示其可能不是抗宮頸癌免疫治療較理想的免疫檢查點。

表3 癌組織中T細胞BTLA的表達與臨床特征的比較

有研究表明宮頸癌的分化程度是淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的獨立危險因素及預后影響因素，低分化者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且預后差[8]。LAN等[9]檢測發(fā)現(xiàn)胃癌根治術后癌組織中BTLA較癌旁組織呈明顯高表達現(xiàn)象，BTLA表達水平與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關。BIAN等[10]發(fā)現(xiàn)血漿中可溶性BTLA>1.91ng/mL與胰腺癌患者OS(overall survival time，總生存時間)低于6月有關。黃維等[11]使用免疫組化技術檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織中BTLA的表達，結(jié)果顯示BTLA的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。本研究結(jié)果顯示BTLACD8+T細胞的表達在低分化癌組織中高于中分化者，提示BTLA在宮頸癌中高表達可能與預后不良相關，尚需進一步擴大樣本開展深入研究。

文獻報道動態(tài)監(jiān)測治療前后外周血單核細胞不同免疫檢查點的表達量，有助于免疫治療療效的評估[12]。Chen等[13]對比局部晚期食管鱗癌患者外周血CD4+和CD8 +T細胞在同步放化療前后占總T細胞比例的變化，發(fā)現(xiàn)治療后CD4+和CD8+T細胞占總T細胞比例升高者較比例降低者預后好。惡性腫瘤家族史是宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等家族聚集性現(xiàn)象腫瘤的重要危險因素，所以有惡性腫瘤家族史者可能更注重對腫瘤的篩查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療[14-15]。本研究結(jié)果提示，BTLA在有無惡性腫瘤家族史CSCC患者癌組織T細胞上的表達差異有統(tǒng)計學意義，但由于有腫瘤家族史的病例數(shù)少，該結(jié)果可能存在偏倚，有待擴大樣本量進一步研究。本研究顯示CSCC患者外周血BTLACD8+T細胞上的表達與不同腫瘤大體類型的差異有統(tǒng)計學意義，但還需進一步擴大樣本量證實這一點。