童卓云， 斯依提·阿木提， 劉文娟， 張盼盼， 阿地力江·伊明

(1新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院檢驗科， 烏魯木齊 830000; 2新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，育齡期夫婦在1年以上未進行任何避孕措施下，進行有規(guī)律的性生活仍無法受孕為不孕不育癥，男性則為不育癥。近年來，男性不育癥患病率呈增長趨勢，精液質(zhì)量呈逐年降低趨勢[1-2]。研究表明，全球約15%育齡夫婦面臨不孕不育的困擾[3]，亞洲地區(qū)僅男性因素造成的不孕不育達37 %。有學(xué)者通過冷水浸沒[4]、短期冷暴露[5]等急性造模方式進行了冷刺激對精子功能影響的研究和報道，但是，將冷環(huán)境作為致病因素，將弱精子癥作為一項疾病，模擬其發(fā)生發(fā)展過程并建立模型的系統(tǒng)性研究則鮮有報道。本研究采用冷環(huán)境刺激干預(yù)建立弱精子癥大鼠模型，探究弱精子癥大鼠精子功能及其性腺軸神經(jīng)內(nèi)分泌機制的改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器DHP-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器有限公司)；GC-2016型γ放射免疫計數(shù)器(安徽科大創(chuàng)新股份有限公司)。

1.2 試劑M199培養(yǎng)基(美國Hyclone公司，批號：AE27981284)；胎牛血清(德國BIO-FROXX公司，批號：EZ2811F232)；精子伊紅-苯胺黑活體染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：20190423)。

1.3 實驗動物SPF級清潔雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量(190±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0002。

1.4 建模與分組方法取28只SD大鼠隨機分為正常對照組(12只)和冷刺激建模組(16只)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將2組大鼠分別在正常溫度環(huán)境(22±2)℃和冷環(huán)境(4.0±0.5)℃，10：00～18：00中飼養(yǎng)，光控晝/夜12 h/12 h，大鼠均自由進食飲水。23周后取冷刺激建模組大鼠精子，參照文獻[1]中方法進行精子懸液制備和精子活力檢測與評定，即以前向運動精子(Progressive motility, PR)百分率低于32 %，或前向+非前向運動精子(Progressive motility+Non-progressive motility, PR +NP)百分率低于40 %為弱精子癥大鼠篩選標準，結(jié)果弱精子癥組(8只)，未成模組(8只)，見圖1。

28只性SPF級SD大鼠正常對照組12只冷刺激建模組16只 23周后精子活力檢測23周后精子活力檢測 正常對照組12只未成模組8只精子癥組8只

1.5 組織取材與處理方法造模結(jié)束后將各組大鼠稱重后麻醉，腹主動脈采血制備血清，-80℃凍存?zhèn)溆?。取大鼠左?cè)附睪制作精子懸液，將大鼠下丘腦、垂體、右側(cè)睪丸和右側(cè)附睪用4 %甲醛固定。

1.6 指標測定

1.6.1 精子功能的評定 鈍性分離大鼠左側(cè)附睪尾，剔除周圍脂肪及結(jié)締組織，置于4 mL含有2% BSA的M199培養(yǎng)基中(提前37℃預(yù)熱)，用眼科剪將附睪尾迅速剪碎， 37℃孵育15 min。精子懸液參照參考文獻[1]中方法操作測定精子濃度和活力，參照精子伊紅-苯胺黑活體染色試劑盒說明書方法操作測定精子活率。

1.6.2 器官系數(shù)的測定 稱取各組大鼠睪丸和附睪重量，計算器官系數(shù)。

1.6.3 外周血清性腺軸激素水平的測定 參照放射免疫檢測試劑盒說明書方法操作測定血清中睪酮(Testosterone, T)、雌二醇(Estradiol, E2)、黃體生成素(Luteinizing hormone, LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、泌乳素(Prolactin, PRL)水平。

1.6.4 下丘腦、垂體、睪丸、附睪組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組大鼠下丘腦、垂體、睪丸、附睪組織用4%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片。HE染色，光鏡下觀察各組組織形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 冷刺激建模組大鼠精子濃度、活力、活率的比較與正常對照組相比，冷刺激建模組大鼠精子活力(PR、NP)和活率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 弱精子癥模型組大鼠精子濃度、活力、活率的比較與正常對照組相比，弱精子癥組大鼠精子活力(PR、NP)和活率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表1 冷刺激對大鼠精子濃度、活力和活率的比較

表2 各組大鼠精子濃度、精子活力、精子活率的比較

2.3 各組大鼠弱精子癥成模率的比較與正常對照組相比，冷刺激建模組大鼠弱精子癥成模率增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，χ2=28.000)，見表3。

表3 各組大鼠弱精子癥成模率的比較

2.4 各組大鼠精子伊紅-苯胺黑活率染色結(jié)果比較染色后活精子頭部呈白色，死精子頭部呈紅色。與正常對照組相比，弱精子癥組較多見頭部紅染的精子，見圖2。

a.正常對照組

b.未成模組

c.弱精子癥組

2.5 各組大鼠器官系數(shù)的比較與正常對照組相比，弱精子癥組大鼠睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與未成模組相比，弱精子癥組大鼠睪丸系數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.6 各組大鼠外周血清性腺軸激素含量的比較與正常對照組相比，未成模組、弱精子癥組T含量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常對照組、未成模組相比，弱精子癥組E2水平升高，LH水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表4 各組大鼠睪丸、附睪系數(shù)的比較

2.7 各組大鼠性腺軸相關(guān)組織結(jié)構(gòu)改變情況

2.7.1 下丘腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠下丘腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細胞豐富，未成模組無明顯改變；高倍鏡下可見弱精子癥組大鼠下丘腦組織毛細血管呈袖套狀改變，神經(jīng)元細胞增生，排列紊亂，見圖3。

表5 各組大鼠外周血清性腺軸激素水平的比較

a.正常對照組 (×100)

b.未成模組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

2.7.2 垂體組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠垂體組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細胞呈團索狀分布， 弱精子癥組嗜堿性細胞較少；高倍鏡下冷刺激建模組大鼠垂體組織可見細胞空泡化、細胞水腫及毛細血管擴張，以弱精子癥組更為明顯，見圖4。

2.7.3 睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠睪丸組織多見生精小管緊密排列，生精小管飽滿，以富含精子的生精小管為主。與正常對照組相比，未成模組未見明顯變化，弱精子癥組生精小管間距略寬，高倍鏡下弱精子癥組生精上皮較正常對照組薄，間質(zhì)水腫，可見毛細血管擴張，見圖5。

2.7.4 附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；高倍鏡下正常對照組大鼠附睪組織上皮細胞排列整齊，與正常對照組相比，未成模組、弱精子癥組上皮結(jié)構(gòu)均排列紊亂，上皮變薄，并以弱精子癥組更為明顯，見圖6。

a.正常對照組 (×100)

b.未成模組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

a.正常對照組 (×100)

b.未成模組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

3 討論

弱精子癥作為男性不育的重要原因之一，與男性生活環(huán)境、氣候、物理化學(xué)損傷及生活方式有關(guān)。近年來基于弱精子癥模型研究不斷增加，弱精子癥動物模型多采用化學(xué)損傷[6]、電離輻射等急性損傷方式建立[7]。本研究經(jīng)過23周的慢性、長期冷環(huán)境刺激后，冷刺激建模組大鼠精子活力、活率較正常對照組降低，其中PR降低42.55%，PR+NP降低43.51%，活率降低57.12%，有50%大鼠出現(xiàn)弱精子癥，弱精子癥組較正常對照組PR和PR+NP分別降低82.97%和 79.08%，精子活率則降低57.12%，表明穩(wěn)定的冷環(huán)境慢性、長期刺激下，不僅可以從精子的運動能力和活率層面影響精子功能，進一步發(fā)展后還可形成弱精子癥模型。有報道稱冷水浸沒可導(dǎo)致精子活力降低[4]，與本研究結(jié)果一致，但該研究中冷刺激未引起精子濃度的改變，究其原因可能是大鼠對全身冷環(huán)境刺激與睪丸局部冷刺激產(chǎn)生反應(yīng)的不同有關(guān)。

a.正常對照組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

精子的產(chǎn)生和運動能力有賴于正常的性激素水平，睪丸作為生殖腺，不僅是產(chǎn)生生殖細胞的器官，同時也產(chǎn)生性激素，發(fā)揮內(nèi)分泌功能，受到上級性腺軸激素的調(diào)控，其中腺垂體分泌的LH和FSH可對睪丸生精功能發(fā)揮調(diào)控作用[9]。LH主要作用于睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生T，而FSH主要作用于支持細胞并維持其細胞數(shù)量與功能[10]，促進生精小管產(chǎn)生精子，控制T向E2轉(zhuǎn)化[11]。睪丸內(nèi)高濃度T在精子的生成與成熟過程中發(fā)揮著重要作用，T水平不足可影響精子發(fā)生，導(dǎo)致精子濃度降低[12]。與此同時雌激素在生精過程中也起重要作用，涉及精子正常發(fā)育及形成過程[13-14]。精子自身合成E2可提高精子的運動能力和活率[15-16]。但過高水平E2反而會降低精子運動能力，引起不育[17-18]。因此，致病因素可通過損害性腺軸，發(fā)揮對生殖系統(tǒng)發(fā)育的損害作用[19]。長期冷環(huán)境刺激，使雄性大鼠呈現(xiàn)性腺軸激素紊亂的狀態(tài)，其中E2水平的升高在弱精子癥模型的形成中可能發(fā)揮著重要作用，包括通過負反饋調(diào)節(jié)降低血清LH。T水平升高，無統(tǒng)計學(xué)意義，具體機制尚不清楚。有研究者[5]將勃蘭特田鼠暴露于4℃冷環(huán)境時發(fā)現(xiàn)， T水平在造模后期由降低變?yōu)樯摺Ｒ虼耍琓水平變化可能與冷刺激干預(yù)周期有關(guān)。性腺軸形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，弱精子癥組下丘腦、垂體及睪丸、附睪均產(chǎn)生不同程度的水腫樣病理改變，可能和炎性改變有關(guān)。下丘腦中神經(jīng)元細胞增生、排列紊亂、毛細血管袖套改變及垂體中嗜堿性細胞較少可解釋弱精子癥組顯著降低的LH水平。結(jié)合睪丸、附睪系數(shù)的變化，該弱精子癥模型的發(fā)生發(fā)展中，性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，冷環(huán)境長期刺激下可影響大鼠精子的運動能力，進而誘發(fā)弱精子癥，其機制與性腺軸內(nèi)分泌功能改變相關(guān)，但具體發(fā)病機制尚待進一步研究證實。