史浩楠， 王婷婷， 董惠娟， 張羽珊， 姚 健， 張鵬程

(1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2上海健康醫(yī)學(xué)院護(hù)理與健康管理學(xué)院健康服務(wù)與健康管理教研室， 上海 201318)

2型糖尿病在全世界的發(fā)病率，正呈逐年上升趨勢。在我國，于1979 年、1994 年、2007年以及2010 年分別進(jìn)行了 4 次大規(guī)模的糖尿病流行病學(xué)調(diào)查，于2010年的調(diào)查結(jié)果可知，我國約有近1.139億人患糖尿病[1]。2型糖尿病的發(fā)病與胰島β細(xì)胞受損具有密切關(guān)系[2]，其在環(huán)境以及遺傳等諸多因素的影響下，常表現(xiàn)為胰島素抵抗。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路是細(xì)胞內(nèi)的重要信號傳導(dǎo)通路，其主要作用為促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖，抑制細(xì)胞的生長阻滯與凋亡[3]。近年來，PI3K/AKT通路在肝纖維化、糖尿病與阿爾茨海默病等領(lǐng)域備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4-5]。

糖原合成激酶(GSK-3β)是AKT的重要底物，其對胰島素信號通路具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，并在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起到重要的作用[6-7]。本次實(shí)驗(yàn)在建立2型糖尿病大鼠模型時(shí)，同步使用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002，觀察血糖與骨骼肌組織中GSK-3β蛋白表達(dá)的變化，研究PI3K/AKT信號通路對血糖與GSK-3β的調(diào)節(jié)作用，探討該通路對2型糖尿病發(fā)病的影響，為2型糖尿病的預(yù)防與治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，購買自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)環(huán)境[SCXK(新)2016-0003；使用許可：SYXK(新)2016-0002]。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)、檸檬酸、檸檬酸鈉、膽固醇、果糖、蔗糖、甲基硫脲嘧啶、丙二醇、吐溫80、谷氨酸鈉、戊巴比妥鈉、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(以上均購買自北京索萊寶科技有限公司)，LY294002(美國MCE公司)，兔抗PI3K一抗(武漢華美生物工程有限公司)，兔抗AKT1/2/3一抗(武漢博士德生物科技有限公司)，兔抗GSK-3β一抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)、山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)、GAPDH內(nèi)參蛋白(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)、辣根過氧化酶化學(xué)發(fā)光顯色劑、EDTA蛋白酶抑制劑、考馬斯藍(lán)蛋白定量試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、普通大鼠飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 主要儀器 酶標(biāo)儀(Varioskan Flash)、高速冷凍離心機(jī) (HC-3018R)、低速冷凍離心機(jī)(KDC-2046)、血糖儀及配套試紙(拜安捷2)。

1.2.3 主要溶液的配制

1.2.3.1 脂肪乳的配置 膽固醇6 g，果糖5 g，蔗糖5 g，吐溫-80 6 mL，丙二醇20 mL，谷氨酸鈉1 g，甲基硫脲嘧啶0.5 g，豬油20 g。將新鮮豬板油置于鐵鍋中加熱，直至油渣呈金黃色后，將油渣撈出，待豬油冷卻后，經(jīng)六層紗布過濾，盛放于燒杯中待用。A液：將6 g膽固醇加入20 g豬油中，置于電熱爐上加熱至完全溶解后，向其中加入聚山梨酯-80 20 mL備用；B液：將果糖5 g、蔗糖5 g、甲基硫脲嘧啶0.5 g，谷氨酸鈉1 g加入燒杯，并在燒杯中加入少量蒸餾水，置于電熱爐上加熱至完全溶解后，再向其中加入丙二醇20 mL。將B液倒入A液中，用玻璃棒快速攪拌，與此同時(shí)，向溶液中加入蒸餾水定容至100 mL，待溶液完全冷卻后停止攪拌，制成脂肪乳。

1.2.3.2 STZ的配置 A液：將檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中 ；B液：檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL。將A、B 液按1∶1比例混合，將pH調(diào)至4.2～4.5，經(jīng)滅菌后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩㈡滊遄艟匕凑?%濃度溶解在緩沖液中，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3.3 LY294002溶液的配制 將二甲基亞砜按照2‰濃度溶解在生理鹽水中，配置成2‰DMSO溶液，將LY294002溶解在配置好的DMSO溶液中，濃度為0.05 mg/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即正常對照組(N組)、糖尿病組(G組)、DMSO組(D組)、抑制組(L組)，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，檢測各組大鼠血糖(GLU)。G、D、L組每日灌胃脂肪乳劑，N組灌胃同等劑量的純凈水，劑量為10 mL/kg。同時(shí)N、G組每日腹腔注射生理鹽水，D組每日腹腔注射DMSO溶液，L組每日腹腔注射LY294002溶液，劑量均為6 mL/kg。至實(shí)驗(yàn)第10日，禁食12 h，同時(shí)給G、D、L組腹腔注射STZ溶液，劑量為40 mg/kg，建立糖尿病模型。繼續(xù)干預(yù)至第15日，禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉受試動物，使用組織剪剪開腹腔，腹主動脈取血檢測GLU，處死受試動物，取下右側(cè)股四頭肌，使用錫箔紙包裹置于液氮中速凍，1 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待檢。以1999年WHO推薦的隨機(jī)血漿葡萄糖濃度≥11.1 mmol/L作為糖尿病的成模標(biāo)準(zhǔn)，若未達(dá)標(biāo)則予以剔除。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量 于實(shí)驗(yàn)前測量大鼠體質(zhì)量一次，之后，每2日稱重一次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4.2 血糖(GLU) 于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h后剪尾法收集血液，使用干化學(xué)法檢測血糖，實(shí)驗(yàn)第15日禁食12 h，麻醉后腹主動脈取血檢測GLU。

1.4.3 Western-blot法檢測骨骼肌中PI3K/AKT/GSK-3β表達(dá)水平 (1)取約1 g骨骼肌于錫箔紙包裹的干凈研缽中，完全研磨后放入1.5 mLEP管中，加入1 mL蛋白抽提液(按蛋白酶抑制劑與強(qiáng)RIPA裂解液1∶100比例配置)，渦旋機(jī)混勻，超聲儀破細(xì)胞，14 000 r，4℃，15 min離心，取上清分裝于小EP管中。(2)取5 μL蛋白上清液,用1×PBS稀釋成100 μL，加入1 mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置10 min，取200 μL于酶標(biāo)板，在波長595 nm處檢測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白上清中總蛋白含量。加入1×PBS和4×Loading Buffer，將各組蛋白統(tǒng)一稀釋成2 μg/μL，100℃水浴20 min，流水沖洗15 min降溫,保存于-80低溫冰箱。(3)選用10%的分離膠與5%的濃縮膠，蛋白Marker加樣5 μL，煮好的蛋白樣品加樣20 μL，在80 V電壓下跑膠30 min，100 V電壓跑膠60 min，120 V電轉(zhuǎn)2 h。取出PVDF膜，按照蛋白Marker切割目的蛋白條帶。5%的脫脂奶粉封閉液(1×TBST配制)封閉1 h，加入兔抗鼠一抗(PI3K、AKT、GSK-3β、內(nèi)參GAPDH稀釋比例分別是1∶3 000、1∶200、1∶1 000、1∶3 000)，4℃搖床孵育，次日回收一抗，TBST洗脫三次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶3 000)進(jìn)行孵育2 h。(4)回收二抗，TBST洗3次，每次10 min，ECL(A、B、C組分別按1 000∶1 000∶1配制)顯色，Image Lab曝光條帶。

使用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，采用GAPDH作為內(nèi)參，使用Image Tool軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量水平比較各組體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)前至實(shí)驗(yàn)第10天的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，實(shí)驗(yàn)第12天至第14天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組體質(zhì)量的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)兩兩對比，L組的體質(zhì)量顯著低于其余3組，其余3組間無差異，見表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量的比較

2.2 各組GLU水平比較實(shí)驗(yàn)后，除L組死亡1只動物外，G、D、L組動物糖尿病均已成模。各組大鼠實(shí)驗(yàn)前GLU的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.57,P>0.05)，實(shí)驗(yàn)后各組GLU水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.96,P<0.05),經(jīng)兩兩對比G、D、L組GLU均高于N組，G、D組GLU水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)后L組GLU水平高于其余3組，見表2。

2.3 各組骨骼肌PI3K/AKT/GSK-3β Western-blot法檢測結(jié)果各組PI3K/AKT/GSK-3β表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。PI3K表達(dá)水平G、D、L組均低于N組，G組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L組低于G、D組；AKT表達(dá)G、D、L組均低于N組，G組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L組低于D、G組；GSK-3β表達(dá)G、D、L組高于N組，G組與D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，L組高于D組，見圖1、表3。

表2 各組實(shí)驗(yàn)前后GLU水平比較

圖1 各組骨骼肌PI3K/AKT/GSK-3β

3 討論

糖尿病是一種受環(huán)境因素以及遺傳因素共同影響的疾病，其主要病因是胰島素抵抗[8]。骨骼肌是胰島素抵抗發(fā)生的重要場所，因此本實(shí)驗(yàn)使用骨骼肌作為大鼠組織的研究對象。PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞增殖及凋亡等行為密切相關(guān)，其中PI3K是一類胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，能夠激活蛋白激酶B，抑制下游糖原合成酶的活性，促進(jìn)糖原合成以及葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低血糖水平[9]。AKT是PI3K的下游效應(yīng)分子，有AKT1、AKT2、AKT3 3個(gè)亞型。有研究表明[10],AKT的3個(gè)亞型基因剔除的小鼠均會表現(xiàn)出不同程度的血糖異常,說明AKT在調(diào)節(jié)血糖方面有著重要的作用。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，G組PI3K/AKT的表達(dá)均明顯低于N組，該結(jié)果與師林等[11]和鐘文等[12]研究糖尿病大鼠PI3K/AKT的表達(dá)結(jié)果是一致的。PI3K/AKT信號通路能夠通過磷酸化多種底物，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的生長、增殖并抑制胰島β細(xì)胞凋亡[13],而患糖尿病的大鼠PI3K/AKT表達(dá)水平下降，可能是由于大鼠患糖尿病后，因胰島素抵抗，導(dǎo)致胰島素不能與胰島素受體正常結(jié)合，胰島素受體底物不能被正常激活，從而使其下游信號分子的級聯(lián)反應(yīng)受到了抑制，而PI3K/AKT正是重要的胰島素受體底物，因此其表達(dá)受到了抑制。

GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有研究證實(shí)GSK-3β活性增強(qiáng)可致糖尿病動物產(chǎn)生不利后果[14]。本次實(shí)驗(yàn)中，G組GSK-3β表達(dá)水平顯著高于N組，該結(jié)果與劉冬戀等[15]研究2型糖尿病大鼠骨骼肌GSK-3β表達(dá)的結(jié)果是一致的。胰島素分泌不足是2型糖尿病的典型癥狀，在正常情況下，胰島素可以通過磷酸化GSK-3β使其失活，過度表達(dá)的GSK-3β則可以通過抑制葡萄糖的生物活性，從而降低肌糖原的合成，導(dǎo)致GLU水平升高。通過觀察L組GLU及GSK-3β表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)了，GLU水平可能受到GSK-3β的調(diào)節(jié)，這一結(jié)果與唐皓月等[16]通過對糖尿病的動物使用GSK-3β抑制劑，使得GLU水平降低相符合，提示GSK-3β表達(dá)水平與GLU水平呈正相關(guān)趨勢。L組通過使用PI3K/AKT信號通路抑制劑使GKS-3β表達(dá)水平上升提示，PI3K/AKT信號通路對GLU水平的影響很可能與GSK-3β有關(guān)，并且二者呈負(fù)相關(guān)趨勢。

綜上所述，糖尿病的發(fā)生與PI3K/AKT通路受損具有密切的關(guān)系，其機(jī)制很有可能與GSK-3β有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究PI3K/AKT信號通路在糖尿病發(fā)病中的作用及機(jī)制，能夠?yàn)樘悄虿〉闹委熖峁└嘤袃r(jià)值的依據(jù)。