張光輝，靳如意，張 拴，趙忠孝，韋陳彬

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

甘草又名國老、甜草，是豆科甘草屬多年生的草本沙生植物，我國主要產(chǎn)地為新疆、內(nèi)蒙古、山西、甘肅等地，常用于治療心悸氣短、咽喉腫痛及咳嗽痰多等病癥[1]。甘草有效成分主要為黃酮、三萜和多糖類化合物。多糖是由眾多單糖分子相互締合而成的有機高分子化合物[2]，是生命體的重要組成部分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[3]、抗病毒[4]及抗氧化作用。目前，關(guān)于甘草多糖的提取及其抗氧化活性研究均有報道。楊青青等[5]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了甘草多糖浸膏提取工藝，甘草多糖提取率為12.96%。趙云生等[6]通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化了烏拉爾甘草多糖的水提醇沉提取工藝，考察了粒度、溫度、時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)對烏拉爾甘草多糖提取率的影響。加列西·馬那甫等[7]采用超聲法對甘草籽黃酮及多糖的提取工藝進行了優(yōu)化，并對其抗氧化性進行了評價，結(jié)果表明，甘草籽黃酮、多糖在水楊酸、鄰二氮菲體系中對羥基自由基有一定的清除能力。烏蘭其其格等[8]采用水提醇沉法提取甘草粗多糖，并利用沉淀法對提取的甘草粗多糖進行分離純化，結(jié)果表明，加入醬油的甘草多糖試樣對羥基自由基的清除能力明顯增強。作者在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為響應(yīng)值，以提取溫度、提取時間、料液比為考察因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化甘草多糖提取工藝，并通過測定不同產(chǎn)地甘草多糖對DPPH自由基的清除率來評價其抗氧化活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

甘肅甘草、新疆甘草，陜西興盛德中藥飲片有限責(zé)任公司；內(nèi)蒙古甘草，北京康美制藥有限公司。

D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號110833-201307，純度98%)；DPPH(≥98%),上海源葉生物科技有限公司；苯酚、硫酸、石油醚、乙醇、三氯甲烷、正丁醇，分析純。

KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器、KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DZTW型調(diào)溫電熱套，上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司；HX502T型電子天平，慈溪天東衡器廠；UV1102型紫外可見分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司；SJIA-10N-50A型冷凍干燥箱，寧波雙嘉儀器有限公司。

1.2 甘草多糖的提取

將甘草粉碎成粗粉，用10倍體積石油醚回流脫脂3次，每次2 h，常溫干燥。稱取脫脂甘草粗粉20 g，置于燒杯中，在一定提取溫度下按一定的料液比水提2次，過濾，濾液合并，減壓濃縮，加入5倍體積無水乙醇靜置12 h；過濾，沉淀用無水乙醇洗滌2次，加少量蒸餾水溶解，醇沉，抽濾，冷凍干燥，得甘草多糖粗品。稱取1.0 g甘草多糖粗品，加水溶解，加入25 mL三氯甲烷、5 mL正丁醇，于37 ℃水浴恒溫振蕩15 min，離心，上層清液醇沉，抽濾，冷凍干燥，得甘草多糖。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加水溶解定容至100 mL容量瓶中，得濃度為1.0 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[9-10]。分別準(zhǔn)確移取0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.70 mL、0.80 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加蒸餾水補足至2 mL，滴加5%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸5.00 mL，搖勻，沸水浴25 min顯色，定容至10 mL，測定490 nm處吸光度[11]。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程為y=51.45x-0.0096(R2=0.9914)，表明葡萄糖濃度在20～80 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.4 甘草多糖提取率的測定

采用苯酚-濃硫酸法測定甘草多糖的含量。準(zhǔn)確稱取甘草多糖25.0 mg，加水溶解定容至50 mL，搖勻。準(zhǔn)確移取1.00 mL甘草多糖溶液，按1.3方法顯色，測定490 nm處吸光度，依據(jù)線性回歸方程，按式(1)計算甘草多糖提取率。

(1)

式中：c為多糖濃度，g·mL-1；V為溶液定容體積,mL；n為稀釋倍數(shù)；m為甘草質(zhì)量,g。

1.5 甘草多糖提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

以甘草多糖提取率為評價指標(biāo)，考察提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、提取時間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)對甘草多糖提取率的影響。

1.5.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以提取溫度(X1)、提取時間(X2)和料液比(X3)為考察因素，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗，因素與水平見表1。

1.6 甘草多糖的抗氧化活性

分別稱取3個產(chǎn)地甘草多糖25.0 mg，加水溶解定容至50 mL，得0.50 mg·mL-1樣品溶液。準(zhǔn)確稱取DPPH 1.0 mg，加無水乙醇溶解定容至100 mL，得0.01 mg·mL-1DPPH自由基溶液。

表1 響應(yīng)面實驗的因素與水平

移取2.0 mL 0.50 mg·mL-1樣品溶液于棕色容量瓶中，加入1.0 mL 0.01 mg·mL-1的DPPH自由基溶液、1.0 mL無水乙醇，搖勻，暗處靜置30 min[15]，測定517 nm處吸光度，按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：A參為3.0 mL無水乙醇+1.0 mL DPPH自由基溶液的吸光度[16]；A樣為2.0 mL樣品溶液+1.0 mL DPPH自由基溶液+1.0 mL無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對甘草多糖提取率的影響

稱取0.20 g脫脂甘草粗粉5份，在提取時間為1.0 h、料液比為1∶20的條件下，考察提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對甘草多糖提取率的影響[12]，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取溫度對甘草多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率先升高后降低，當(dāng)提取溫度為60 ℃時，多糖提取率最高。故選擇提取溫度為60 ℃。

2.1.2 提取時間對甘草多糖提取率的影響

稱取0.20 g脫脂甘草粗粉5份，在提取溫度為60 ℃、料液比為1∶20的條件下，考察提取時間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)對甘草多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間對甘草多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

由圖2可知，隨著提取時間的延長，多糖提取率先升高后降低，當(dāng)提取時間為2.0 h時，甘草多糖提取率最高。故選擇提取時間為2.0 h。

2.1.3 料液比對甘草多糖提取率的影響

稱取0.20 g脫脂甘草粗粉5份，在提取溫度為60 ℃、提取時間為2.0 h的條件下，考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)對甘草多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對甘草多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

由圖3可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，多糖提取率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶30時，多糖提取率最高。故選擇料液比為1∶30。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果(表2)

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程可作出各因素交互作用對甘草多糖提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時間的延長，甘草多糖提取率逐漸升高，在2.0 h左右達到最高；但是繼續(xù)延長提取時間，甘草多糖提取率有所下降。隨著提取溫度的升高，甘草多糖提取率逐漸升高，且在60 ℃左右時，甘草多糖提取率達到最高；但是繼續(xù)升高提取溫度，甘草多糖提取率緩慢下降。隨著液料比的減小，甘草多糖提取率逐漸升高，當(dāng)料液比達到1∶30左右時，甘草多糖提取率達到最高，其后升幅逐漸放緩。

2.3 驗證實驗

通過Design-Expert 8分析，預(yù)測最佳提取工藝為：提取溫度60.57 ℃、提取時間1.84 h、料液比 1∶30.92，預(yù)測甘草多糖提取率為20.24%。在此工藝下進行3次驗證實驗，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖提取率分別為(19.89±0.08)%、(11.25±0.10)%、(9.60±0.13)%。表明該提取方法穩(wěn)定，工藝可行。多糖含量大小依次為：甘肅甘草>內(nèi)蒙古甘草>新疆甘草。

2.4 甘草多糖的抗氧化活性

分別量取2.00 mL 0.5 mg·mL-1的甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖提取液，按1.6方法測定DPPH自由基清除率，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地甘草多糖對DPPH自由基清除率比較/%

由表4可知，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖對DPPH自由基的清除率分別為27.17%、31.69%、58.68%。甘肅甘草多糖含量雖最高，但是在同濃度的情況下，新疆甘草多糖的抗氧化活性最強，說明抗氧化活性和多糖含量并沒有必然聯(lián)系，推測不同產(chǎn)地的甘草多糖結(jié)構(gòu)并不相同，導(dǎo)致同濃度下抗氧化活性的差異。

圖4 各因素交互作用對甘草多糖提取率的影響Fig.4 Effect of interaction between each factor on extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 重復(fù)性實驗

移取0.5 mg·mL-1甘肅甘草多糖溶液6份，按1.6方法測定吸光度，計算得DPPH自由基清除率分別為27.07%、27.10%、27.16%、27.05%、27.11%、27.13%，RSD為3.98%(n=6)。表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實驗

移取0.5 mg·mL-1甘肅甘草多糖溶液1份，按1.6方法每隔10 min測定吸光度，測定6次，計算得DPPH自由基清除率分別為27.12%、27.14%、27.14%、27.15%、27.17%、27.20%， RSD為2.80%(n=6) 。表明甘肅甘草多糖溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.2 精密度實驗

移取0.5 mg·mL-1甘肅甘草多糖溶液1份，按1.6方法連續(xù)測定吸光度6次，計算得DPPH自由基清除率分別為27.11%、27.12%、27.14%、27.09%、27.11%、27.13%，RSD為1.75%(n=6) 。表明該方法精密度良好。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了甘草多糖的提取工藝，確定最佳提取工藝為：提取溫度60.57 ℃、提取時間1.84 h、料液比 1∶30.92(g∶mL)，在此條件下，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖提取率分別為(19.89±0.08)%、(11.25±0.10)%、(9.60±0.13)%。當(dāng)甘草多糖濃度為0.50 mg·mL-1時，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖對DPPH自由基的清除率分別為27.17%、31.69%、58.68%?？寡趸钚源笮∫来螢椋盒陆什荻嗵?內(nèi)蒙古甘草多糖>甘肅甘草多糖。該工藝實現(xiàn)了甘草多糖的高效提取，為甘草資源的開發(fā)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。