姜 敏，田樹革，李柯翱，季志紅*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆奇沐醫(yī)藥研究院(有限公司)，新疆 烏魯木齊 830011)

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

阿爾泰金蓮花，采自新疆博樂溫泉，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為毛茛科、金蓮花屬阿爾泰金蓮花(Trolliusaltaicus)。

牡荊素(批號20160201)，寶雞辰光生物科技有限公司；葒草苷(批號H-044-181216)，成都瑞芬思生物科技有限公司；腦心浸出液BHI，北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

752型紫外可見分光光度計，ME204E型電子天平，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，潔凈工作臺，SJ-3F型pH計，全自動式電熱高壓蒸汽滅菌器。

1.2 菌株的培養(yǎng)及菌懸液的制備

將變異鏈球菌菌株(ATCC 76100)從超低溫冰箱中取出，在BHI液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇48 h；采用平板劃線法將其接種到BHI瓊脂板上，37 ℃、5%CO2厭氧培養(yǎng)24 h；涂片，顯微鑒定為純培養(yǎng)物。采用取菌環(huán)取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用生理鹽水將菌懸液稀釋至106CFU·mL-1。

1.3 阿爾泰金蓮花提取物的制備

稱取阿爾泰金蓮花粗粉10 g，用10倍量30%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并濾液，濃縮至浸膏狀后，冷凍干燥，備用。

1.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

參照文獻(xiàn)[11]，采用微量稀釋法測定MIC。配制50 mg·mL-1的阿爾泰金蓮花提取物溶液，無菌濾頭濾菌后，稀釋至50～3.125 mg·mL-1，依次向96孔板中加入等量不同濃度的阿爾泰金蓮花提取物與菌懸液(106CFU·mL-1)，輕微振蕩混勻，37 ℃、5%CO2孵育24 h，取出觀察；以不加阿爾泰金蓮花提取物為空白對照組，每個濃度設(shè)3個重復(fù)?？變?nèi)液體清澈透明，沒有細(xì)菌生長的最小濃度即為MIC。

在MIC測定的基礎(chǔ)上，選擇96孔板中濃度≥MIC的菌懸液，用取菌環(huán)蘸取菌懸液后在BHI平板上劃線培養(yǎng)24 h，平板上沒有菌落出現(xiàn)的濃度即為MBC。

1.5 生長曲線的繪制

將106CFU·mL-1菌懸液與含有不同濃度(MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)阿爾泰金蓮花提取物的BHI液體培養(yǎng)基分別等量加入無菌試管中，37 ℃、5%CO2厭氧培養(yǎng)，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、14 h、18 h、22 h、26 h、30 h取樣測定OD600值；以不加藥物為空白對照組，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。為避免阿爾泰金蓮花提取物本身顏色的干擾，取不同時段OD600差值繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.6 ΔpH值和LDH活性的測定

按體積比1∶10將菌懸液與含有不同濃度(MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)阿爾泰金蓮花提取物的BHI溶液混合，測定上清液的pH值(pH初始)；37 ℃、5%CO2厭氧培養(yǎng)18 h后，3 300 r·min-1離心20 min，測定上清液的pH值(pH結(jié)束)，并按所提供試劑盒說明測定LDH活性；以不含藥物的菌懸液為空白對照組，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。以ΔpH值(pH初始-pH結(jié)束)評價阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響。按式(1)計算LDH活性(U·L-1)：

×1000

(1)

1.7 抗氧化活性評價

1.7.1 DPPH自由基清除實驗

在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。配制0.1 mg·mL-1阿爾泰金蓮花提取物溶液，分別稀釋成0.000 3 mg·mL-1、0.000 5 mg·mL-1、0.001 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.004 mg·mL-1、0.006 mg·mL-1、0.008 mg·mL-1、0.01 mg·mL-1的樣品溶液。將3 mL樣品溶液與2 mL 1×10-4mol·L-1DPPH自由基溶液在室溫下混合均勻后，避光靜置30 min，以相應(yīng)溶劑為參比測定520 nm處吸光度；以VC為陽性對照。每個樣品平行測定3次，按式(2)計算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0為2 mL DPPH+3 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL無水乙醇+3 mL樣品溶液的吸光度；A2為2 mL DPPH+3 mL樣品溶液的吸光度。

同法測定葒草苷和牡荊素對DPPH自由基的清除率。

1.7.2 ABTS自由基清除實驗

在文獻(xiàn)[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。將10 mmol·L-1ABTS自由基溶液與10 mmol·L-1K2S2O8溶液混合，過夜靜置16 h，得ABTS儲備液，用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02。配制0.4 mg·mL-1阿爾泰金蓮花提取物溶液，分別稀釋成0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1的樣品溶液。將0.2 mL樣品溶液與3.9 mL ABTS自由基溶液在室溫下混合均勻后，避光靜置15 min，以相應(yīng)溶劑為參比測定吸光度；以VC為陽性對照。每個樣品平行測3次，按式(3)計算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A0為3.9 mL ABTS +0.2 mL無水乙醇的吸光度；A1為3.9 mL無水乙醇+0.2 mL樣品溶液的吸光度；A2為3.9 mL ABTS +0.2 mL樣品溶液的吸光度。

同法測定葒草苷和牡荊素對ABTS自由基的清除率。

(4)

式中：A0為用1 mL無水乙醇代替樣品溶液的吸光度；A1為1 mL 10 mmol·L-1HCl溶液代替鄰苯三酚溶液的吸光度；A2為Tris-HCl緩沖液加不同濃度樣品溶液的吸光度。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。首先通過Shapiro-Wilk檢驗確認(rèn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，若方差齊，使用LSD-t檢驗進(jìn)行組間比較，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿爾泰金蓮花提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

微量稀釋法測定結(jié)果顯示，當(dāng)阿爾泰金蓮花提取物濃度≥12.5 mg·mL-1時，所對應(yīng)的96孔板內(nèi)的溶液均清澈透明，所以MIC為12.5 mg·mL-1。當(dāng)阿爾泰金蓮花提取物濃度為25 mg·mL-1時，BHI平板上沒有細(xì)菌生長，所以MBC為25 mg·mL-1。

2.2 阿爾泰金蓮花提取物的抑菌作用(圖1)

圖1 阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌的抑菌作用Fig.1 Antibacterial effect of Trollius altaicus extract on S.mutans

由圖1可知，在培養(yǎng)的前14 h，藥物組中變異鏈球菌的增殖速度均小于空白對照組。根據(jù)生長曲線可知，空白對照組在培養(yǎng)2 h后就進(jìn)入了對數(shù)生長期；14 h后，各濃度阿爾泰金蓮花提取物作用后變異鏈球菌的增殖速度減緩。與空白對照組相比，阿爾泰金蓮花提取物濃度越大，變異鏈球菌進(jìn)入對數(shù)生長期越晚。

2.3 阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響(表1)

表1 不同濃度阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

由表1可知，藥物組隨著阿爾泰金蓮花提取物濃度的增大，ΔpH值從0.49±0.03下降到0.09±0.03。各濃度藥物組培養(yǎng)液的ΔpH值均低于空白對照組的ΔpH值，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌LDH活性的影響(圖2)

由圖2可知，與空白對照組相比，各濃度阿爾泰金蓮花提取物作用于變異鏈球菌后，LDH活性均顯著降低(P<0.05)；且隨著藥物濃度的增大，LDH活性呈下降趨勢，表明阿爾泰金蓮花提取物抑制LDH活性能力逐漸增強(qiáng)。

圖2 阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌乳酸脫 氫酶活性的影響Fig.2 Effect of Trollius altaicus extract on LDH activity of S.mutans

2.5 阿爾泰金蓮花提取物的抗氧化活性

2.5.1 阿爾泰金蓮花提取物對DPPH自由基的清除作用(圖3)

圖3 阿爾泰金蓮花提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of Trollius altaicus extract on DPPH free radicals

由圖3可知，除牡荊素外，阿爾泰金蓮花提取物、葒草苷、VC在一定濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除作用具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度低于0.008 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率大小依次為VC>葒草苷>阿爾泰金蓮花提取物>牡荊素。

2.5.2 阿爾泰金蓮花提取物對ABTS自由基的清除作用(圖4)

由圖4可知，隨著濃度的增大，牡荊素與阿爾泰金蓮花提取物對ABTS自由基的清除率逐漸升高，但量效關(guān)系不明顯；VC與葒草苷對ABTS自由基的清除率逐漸升高，且具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)VC與紅草苷基本將ABTS自由基清除完全時，阿爾泰金蓮花提取物對ABTS自由基的清除率為49.48%，牡荊素僅為10.41%。在一定濃度范圍內(nèi)，對ABTS自由基的清除率大小依次為VC>葒草苷>阿爾泰金蓮花提取物>牡荊素；當(dāng)濃度超過0.15 mg·mL-1后，VC與葒草苷對ABTS自由基的清除率基本保持不變，說明這2種藥物對ABTS自由基的清除作用已經(jīng)達(dá)到飽和，且葒草苷對ABTS自由基的清除作用與VC基本相當(dāng)。

圖4 阿爾泰金蓮花提取物對ABTS自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of Trollius altaicus extract on ABTS free radicals

圖5 阿爾泰金蓮花提取物對的清除作用Fig.5 Scavenging effect of Trollius altaicus extract on

2.6 討論

齲齒是一種常見的慢性細(xì)菌感染性口腔疾病，糖攝入量以及口腔衛(wèi)生習(xí)慣、口腔菌群的改變都是導(dǎo)致齲齒產(chǎn)生的關(guān)鍵原因?，F(xiàn)廣泛采用抗生素和氟化物治療，雖然具有一定的治療效果，但是在使用過程中出現(xiàn)的耐藥性以及抗生素濫用等現(xiàn)象也引起人們的廣泛關(guān)注。近年來，研究者更加關(guān)注天然產(chǎn)物在口腔疾病方面的應(yīng)用。

變異鏈球菌可以在牙釉質(zhì)表面形成菌斑生物膜從而可以不受外界環(huán)境干擾定植在口腔中[15]，形成的生物膜成為隔絕變異鏈球菌與外界環(huán)境的有利屏障，使膜內(nèi)的細(xì)菌生長在厭氧和酸性的環(huán)境中[16]，從而給齲齒的發(fā)生提供了有利的環(huán)境條件。因此，抑制變異鏈球菌的生長和降低LDH活性是治療口腔疾病的關(guān)鍵。對口腔致齲菌的研究需要從藥物對變異鏈球菌的生長、酸代謝、LDH活性的影響以及清除自由基等多方面進(jìn)行。

本研究通過微量稀釋法測定了阿爾泰金蓮花提取物對變異鏈球菌的MIC與MBC值，測得MIC值為12.5 mg·mL-1，MBC值為25 mg·mL-1。通過繪制變異鏈球菌的生長曲線，可以直觀地反映阿爾泰金蓮花提取物濃度對其生長水平的影響。結(jié)果表明，在本實驗設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，阿爾泰金蓮花提取物的濃度越大，對變異鏈球菌生長的抑制作用越強(qiáng)。

變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力與致齲能力具有相關(guān)性。產(chǎn)酸實驗結(jié)果表明，隨著阿爾泰金蓮花提取物濃度的增大，ΔpH值逐漸減小，抑制產(chǎn)酸作用逐漸增強(qiáng)。綜上，阿爾泰金蓮花提取物不僅能有效抑制變異鏈球菌的生長，還能抑制其產(chǎn)酸。

研究發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力除受其它信使分子的調(diào)控外[17]，LDH也是其產(chǎn)酸過程中的重要因子。LDH在菌體內(nèi)部和外部均有分布，可以通過菌懸液測定其活性[18]。以1/8MIC～MIC濃度的阿爾泰金蓮花提取液作用于變異鏈球菌后，藥物組菌懸液的LDH活性較空白對照組明顯下降(P<0.05)?？沙醪酵茢啵柼┙鹕徎ㄌ崛∥镆种谱儺愭溓蚓淖饔猛緩綖椋和ㄟ^抑制LDH活性，影響丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，從而抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)液pH值。

3 結(jié)論