付 晶,呂 洋,程振玉*

(1.阜新市環(huán)境監(jiān)測中心站，遼寧 阜新 123000; 2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

龍膽屬于龍膽科植物龍膽(GentianascabraBunge)、條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall.)的干燥根和莖，在臨床實(shí)踐中可用于保護(hù)人體的胃、肝、膽等器官，近年來在抗腫瘤方面也表現(xiàn)出了令人滿意的治療效果[1]。研究表明，多糖類物質(zhì)是龍膽草最主要的活性成分之一，具有降血糖[2]、降血脂、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、保肝[5]、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎等療效。目前，常采用熱水回流法[6]、微波法[7]、超聲波法[8]等提取龍膽多糖。熱水回流法提取溫度高，且提取率較低；超聲波法和微波法設(shè)備昂貴，且有可能引起糖苷鍵的斷裂。果膠酶法可以有效破壞植物細(xì)胞壁，使植物細(xì)胞內(nèi)的有效物質(zhì)充分溶出，且不破壞其活性，是一種非常有前景的提取技術(shù)[9]。果膠酶法具有提取溫度適中、操作方便、目標(biāo)成分得率高等優(yōu)點(diǎn)，在黃酮類、木質(zhì)素、植物多糖等天然產(chǎn)物活性成分的提取中受到越來越多的關(guān)注。因此，作者以龍膽多糖提取率為評價指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化龍膽多糖的果膠酶法提取工藝，并通過測定龍膽多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除率來評價其抗氧化活性，以期為工業(yè)化提取龍膽多糖奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

龍膽草，市售；果膠酶，北京奧博新生物技術(shù)有限公司。

苯酚、無水乙醇、葡萄糖對照品，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；濃硫酸，分析純，天津天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

FA2004型電子分析天平，上海精天電子儀器有限公司；DZF-6050型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，鞏義英峪儀器一廠；RT-08型多功能粉碎機(jī)，榮聰精密科技有限公司；722型紫外可見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 龍膽多糖的提取

將干燥且粉碎的龍膽草過60目篩，準(zhǔn)確稱量1.0 g置于平底燒瓶中，加入一定質(zhì)量的果膠酶和一定體積的蒸餾水，在一定溫度下提取一段時間；抽濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量；加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%進(jìn)行沉淀，靜置過夜；抽濾，收集濾餅，用無水乙醇洗滌3次，得龍膽多糖。

1.3 龍膽多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[9]。以葡萄糖濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0097c-0.0057，R2=0.9995。按下式計(jì)算龍膽多糖提取率：

1.4 龍膽多糖提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察果膠酶用量(0.01 g、0.02 g、0.03 g、0.04 g、0.05 g)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、提取溫度(35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃)、提取時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)、pH值(1、2、3、4、5、6、7)對龍膽多糖提取率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[10-11]對影響多糖提取率的參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.5 龍膽多糖的抗氧化活性評價

參照文獻(xiàn)[10]方法，測定龍膽多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除率，對龍膽多糖的抗氧化活性進(jìn)行評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 果膠酶用量對龍膽多糖提取率的影響(圖1)

圖1 果膠酶用量對龍膽多糖提取率的影響Fig.1 Effect of pectinase dosage on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

酶用量對天然產(chǎn)物中活性成分的提取效果影響較大。由圖1可知，當(dāng)果膠酶用量由0.01 g增加到0.04 g時，龍膽多糖提取率逐漸升高；但是進(jìn)一步增加果膠酶用量，提取率反而降低。因此，選擇最佳的果膠酶用量為0.04 g，即4%(以龍膽草質(zhì)量計(jì))。

2.1.2 料液比對龍膽多糖提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對龍膽多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由圖2可知，當(dāng)料液比由1∶10減小到1∶40時，即提取溶劑用量由10 mL增加到40 mL，龍膽多糖提取率逐漸升高；但是進(jìn)一步增加提取溶劑用量，提取率反而降低。原因可能是，提取溶劑用量較少時，一些多糖尚未溶出，導(dǎo)致多糖提取率較低；但當(dāng)提取溶劑過多時，雜質(zhì)亦會提取出來，從而抑制多糖的提取。因此，選擇最佳的料液比為1∶40。

2.1.3 提取溫度對龍膽多糖提取率的影響(圖3)

圖3 提取溫度對龍膽多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由圖3可知，當(dāng)提取溫度由35 ℃升至65 ℃時，龍膽多糖提取率逐漸升高；但當(dāng)提取溫度超過65 ℃后，多糖提取率開始下降。原因可能是，隨著提取溫度的升高，果膠酶的活性也隨之增強(qiáng)，大大提高了果膠酶對細(xì)胞壁的破壞程度，利于多糖更加充分地溶出；但當(dāng)提取溫度過高時，會使果膠酶部分失去活性或多糖糖苷鍵斷裂，影響多糖的溶出。因此，選擇適宜的提取溫度范圍為55～75 ℃。

2.1.4 提取時間對龍膽多糖提取率的影響(圖4)

圖4 提取時間對龍膽多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由圖4可知，在5 h內(nèi)時，隨著提取時間的延長，龍膽多糖提取率逐漸升高。原因可能是，隨著提取時間的延長，果膠酶與龍膽草作用時間延長，從而使龍膽草的細(xì)胞壁被充分破壞，利于多糖的溶出；但當(dāng)提取時間過長時，雜質(zhì)亦會提取出來，從而抑制多糖的提取。因此，選擇適宜的提取時間范圍為4～6 h。

2.1.5 pH值對龍膽多糖提取率的影響(圖5)

圖5 pH值對龍膽多糖提取率的影響Fig.5 Effect of pH value on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由圖5可知，當(dāng)pH值在1～2之間時，隨著pH值的增大，多糖提取率逐漸升高；但當(dāng)pH值超過2時，多糖提取率反而下降。因此，選擇適宜的pH值范圍為1～3。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(表2)

采用多元回歸分析法，對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得果膠酶法提取龍膽多糖工藝的二元多次回歸方程為：Y=17.11-1.08A+1.09B-0.076C-0.51AB+1AC-0.29BC+0.59A2-3.28B2-2.84C2。

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察?；貧w方程的方差分析見表3。

由表3可知，模型的F=3.86，P<0.05，表明實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有顯著性。在總的作用因素中， pH值、提取時間和提取溫度對龍膽多糖提取率的影響均不顯著；各考察因素對多糖提取率的影響不能用線性關(guān)系來表示，因素之間的交互作用影響不顯著。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對龍膽多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對龍膽多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of polysaccharides from Gentiana scabra

由圖6可知，提取時間和提取溫度兩個因素對龍膽多糖提取率的影響較顯著，表現(xiàn)為曲線變化較陡，當(dāng)其數(shù)值增大或減小時，龍膽多糖提取率有著較大的變化；pH值對龍膽多糖提取率的影響較小，曲線較為平滑，其數(shù)值的增大或減小對龍膽多糖提取率的影響較小。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇Design-Expert軟件，結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果對考察因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：果膠酶用量4%(以龍膽草質(zhì)量計(jì))、料液比1∶40、提取溫度62.98 ℃、提取時間5.25 h、pH值1。按優(yōu)化后的最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，龍膽多糖提取率達(dá)到17.69%，與模型預(yù)測值(17.92%)基本一致。

2.3 龍膽多糖的抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除率

不同濃度的龍膽多糖溶液和VC對DPPH自由基的清除率見表4。

由表4可知，當(dāng)龍膽多糖溶液濃度從0.2 mg·mL-1增加到1.0 mg·mL-1時， DPPH自由基清除率也隨之升高，即清除率與龍膽多糖的濃度存在明顯的量效關(guān)系。但與VC相比，龍膽多糖對DPPH自由基的清除作用較弱。

表4 DPPH自由基清除率測定結(jié)果

2.3.2 對羥基自由基的清除率

不同濃度的龍膽多糖溶液和VC對羥基自由基的清除率見表5。

表5 羥基自由基清除率測定結(jié)果

由表5可知，當(dāng)龍膽多糖溶液濃度從0.2 mg·mL-1增加到1.0 mg·mL-1時，龍膽多糖對羥基自由基的清除率也隨之升高，且清除率均超過50%，但較相同濃度的VC低。龍膽多糖對羥基自由基有顯著的清除作用，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3 結(jié)論

以龍膽多糖提取率為評價指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了龍膽多糖的果膠酶法提取工藝。確定果膠酶法提取龍膽多糖的最佳工藝條件為:果膠酶用量4%(以龍膽草質(zhì)量計(jì))、料液比1∶40 (g∶mL)、提取溫度62.98 ℃、提取時間5.25 h、pH值1，在此條件下，龍膽多糖提取率達(dá)到17.69%。龍膽多糖具有較好的抗氧化活性，且其抗氧化活性與濃度存在一定的量效關(guān)系。該方法操作簡便、綠色無污染、多糖提取率高，為龍膽多糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。