李大鵬 徐從艷 金滄海 劉勇

[摘要] 目的 以慢病毒介導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人髓核細胞，建立永生化髓核細胞系，為后期轉(zhuǎn)基因與動物實驗提供種子細胞。方法 利用機械與酶消化的方法獲得正常的人椎間盤髓核細胞，將構(gòu)建好的重組慢病毒-hTERT（pLVX-hTERT）轉(zhuǎn)染第2代體外單層培養(yǎng)的髓核細胞。用重組慢病毒-增強型綠色熒光蛋白作為標(biāo)記物，在熒光電鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，按感染復(fù)數(shù)（MOI）40、60、80、100設(shè)組，選擇出病毒轉(zhuǎn)染的最佳MOI;設(shè)立pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組、空病毒轉(zhuǎn)染對照組及空白細胞對照組。在倒置顯微鏡下觀察髓核細胞的形態(tài)，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、細胞免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后hTERT基因在髓核細胞內(nèi)的表達情況，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測髓核細胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達情況。結(jié)果 慢病毒轉(zhuǎn)染細胞后第6天，MOI為100時轉(zhuǎn)染效率最高，可達82.9%。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后第7、15、30、60、90天均可檢測到hTERT基因的表達，而兩對照組則未見表達。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組保持了髓核細胞的形態(tài)，兩對照組的細胞則出現(xiàn)返祖現(xiàn)象。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組細胞的蛋白多糖及Ⅱ型膠原基因表達水平較其他兩組均明顯增高（F=173.5、111.1，P<0.05），而兩對照組之間則無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 pLVX-hTERT成功轉(zhuǎn)染人椎間盤髓核細胞，轉(zhuǎn)染pLVX-hTERT后的髓核細胞持續(xù)表達hTERT，獲得永生化的能力，且分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖的量增加。

[關(guān)鍵詞] 末端轉(zhuǎn)移酶端粒;慢病毒屬;轉(zhuǎn)染;髓核;膠原Ⅱ型;蛋白聚糖類

[中圖分類號] R394;R681.5 ?[文獻標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）05-0531-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.122 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[ABSTRACT] Objective To construct an immortalized nucleus pulposus cell line using the human nucleus pulposus cells cultured in vitro and transfected with the lentivirus-mediated human telomerase reverse transcriptase （hTERT） gene， and to provide seed cells for transgenic and animal experiments in future. ?Methods The mechanical and enzymatic digestion method was used to obtain normal human nucleus pulposus cells of the intervertebral disc， and the second-generation monolayer nucleus pulposus cells cultured in vitro were transfected with recombinant lentivirus-hTERT （pLVX-hTERT）. With the recombinant lentivirus-enhanced green fluorescent protein as a marker， a fluorescent electron microscope was used to observe transfection efficiency. The cells were divided into groups based on a multiplicity of infection （MOI） of 40， 60， 80， and 100 to screen out the optimal MOI. The pLVX-hTERT transfection group， the empty virus transfection group， and the blank control group were established. An inverted microscope was used to observe the morphology of nucleus pulposus cells; RT-PCR and cell immunofluorescence were used to measure the expression of the hTERT gene in nucleus pulposus cells after transfection， and RT-PCR was used to measure the expression of type Ⅱ collagen and proteoglycan in nucleus pulposus cells. Results On day 6 after lentiviral transfection， the transfection efficiency reached the highest level of 82.9% at the MOI of 100. The expression of the hTERT gene was observed in the pLVX-hTERT transfection group on days 7，15，30，60， and 90 after transfection， while such expression was not observed in the two control groups. The morphology of the nucleus pulposus cells was maintained in the pLVX-hTERT transfection group， while atavism was observed in the two control groups. The pLVX-hTERT transfection group had significantly higher mRNA expression of proteoglycan and type Ⅱ collagen than the other two groups （F=173.5，111.1;P<0.05）， while there were no significant diffe-rences between the two control groups （P>0.05）. ?Conclusion Human nucleus pulposus cells of the intervertebral disc are successfully transfected with pLVX-hTERT， and after pLVX-hTERT transfection， nucleus pulposus cells have persistent expression of hTERT and thus acquire the ability for immortalization， with increases in the secretion of type Ⅱ collagen and proteoglycan.

[KEY WORDS] lentivirus; nucleus pulposus; transfection; immortalized; collagen type Ⅱ; proteoglycans

隨著社會人口老齡化，腰椎間盤突出癥和慢性腰痛的發(fā)病率逐年增高，而椎間盤內(nèi)的髓核細胞逐漸衰老、凋亡是椎間盤退變的主要病因之一[1]。髓核細胞的活性降低，致使椎間盤內(nèi)水分、膠原、蛋白多糖等丟失，MR檢查表現(xiàn)為T2值下降，可從影像學(xué)上證實椎間盤的退變[2]。隨著國內(nèi)外學(xué)者對椎間盤細胞外基質(zhì)合成與分解關(guān)系研究的深入，應(yīng)用生物學(xué)方法治療椎間盤退變疾病成為近年來基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點[3]。髓核細胞是分泌髓核內(nèi)基質(zhì)的主要細胞，但在體內(nèi)含量較少且活性較低，在體外培養(yǎng)容易發(fā)生去分化，喪失正常髓核細胞的表型與功能[4]，這限制了其在生物學(xué)治療脊椎退行性變方面的應(yīng)用。為解決髓核細胞體外培養(yǎng)去分化的問題，有研究者利用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因的生物學(xué)作用誘導(dǎo)端粒長度，進而克服髓核細胞的衰老和凋亡[5]。hTERT轉(zhuǎn)染建立的細胞系是正常細胞，具有正常的核型和細胞功能[6]。本實驗以慢病毒介導(dǎo)hTERT基因轉(zhuǎn)染正常髓核細胞，建立永生化髓核細胞系，以期為后續(xù)髓核細胞移植治療腰椎退行性變疾病的動物實驗提供種子細胞。

1 材料與方法

1.1 主要材料

重組慢病毒-hTERT（pLVX-hTERT，病毒滴度為1×1011/L）和重組慢病毒-增強型綠色熒光蛋白（pLVX-EGFP，病毒滴度為1×1010/L），由深圳百恩維生物科技有限公司包裝。DMEM培養(yǎng)液（Hyclone），胎牛血清（FBS，Gibco），Trizol液（Invitrogen），胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、PBS（碧云天），兔抗hTERT多克隆抗體（博奧森），熒光素標(biāo)記抗兔IgG（中杉金橋）。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析儀、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（Takaka）、PCR引物甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、2 g/L Triton X100和40 g/L多聚甲醛由青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室提供。hTERT、Ⅱ型膠原及蛋白多糖引物由上海生物公司合成。

1.2 正常人椎間盤髓核細胞的提取與培養(yǎng)

本實驗的椎間盤髓核標(biāo)本來源于1例17歲男性的正常椎間盤髓核組織（病人為車禍傷，同意標(biāo)本采集并簽署知情同意書）。將標(biāo)本自手術(shù)室取出后，迅速放入超凈工作臺內(nèi)培養(yǎng)皿中，用PBS 清洗3 次，仔細辨認分離出髓核組織，用眼科剪將髓核組織修剪成1 mm3大小的組織塊，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化20 min，低速離心去上清，加入Ⅱ型膠原酶（使其工作濃度為2.0 g/L），置于37 ℃的水浴鍋中消化4～6 h，將消化液用100 μm 的細胞篩過濾，收集細胞。以每瓶4×105個的細胞密度將細胞培養(yǎng)于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以含體積分數(shù)0.10 FBS的DMEM為培養(yǎng)液，置于含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后第1次換液，貼壁生長后2～3 d 換液1次，待細胞生長至80%～90%融合時傳代接種到6孔板中，每孔1×105個細胞。

1.3 實驗分組及處理

用pLVX-EGFP作為標(biāo)記物，在熒光電鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，按感染復(fù)數(shù)（MOI）40、60、80、100在96孔板中設(shè)組，選擇出病毒轉(zhuǎn)染的最佳MOI。實驗分為pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組（C組）、空病毒轉(zhuǎn)染對照組（B組）以及空白細胞對照組（A組）。待第2代的髓核細胞達到70%～80%融合時，pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組和空病毒轉(zhuǎn)染對照組分別以pLVX-hTERT和空病毒載體進行轉(zhuǎn)染（空白細胞對照組不轉(zhuǎn)染），轉(zhuǎn)染前用PBS 清洗細胞2次，按篩選出的最佳MOI 加入病毒轉(zhuǎn)染液3 mL，置于含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去病毒轉(zhuǎn)染液，使用PBS沖洗2次，加入含體積分數(shù)0.10 FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染后72 h及傳代后在熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染情況及細胞狀態(tài)。

1.4 各組hTERT及Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因表達的RT-PCR檢測

為檢測pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后hTERT轉(zhuǎn)錄水平及hTERT對Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達水平的影響，分別于轉(zhuǎn)染后第7、15、30、60、90天時檢測hTERT的基因表達水平，分別于轉(zhuǎn)染后第7、15、30、60天時檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖的基因表達水平。由于髓核細胞在體外培養(yǎng)隨著傳代次數(shù)的增加，細胞出現(xiàn)反分化現(xiàn)象，失去髓核細胞特性，故兩對照組僅于第7天時測量蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達水平。取各組細胞各自混勻后，用Trizol法提取各組RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板在PCR儀上進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物以20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。RT-PCR引物序列及反應(yīng)條件見表1。hTERT、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達水平以目的基因與內(nèi)參基因GAPDH灰度值的比值表示。

1.5 各組hTERT 蛋白表達的細胞免疫熒光檢測

分別于轉(zhuǎn)染后第7、15、30、60、90天時，取各組髓核細胞進行細胞爬片，24 h后用40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min;用PBS洗3次，每次3～5 min;加2 g/L Triton X100室溫孵育5 min;用PBS洗3次，每次3～5 min;以體積分數(shù)0.10正常山羊血清封閉其他抗原30 min;滴加一抗（1∶100）4 ℃孵育過夜;PBS洗3次，每次3～5 min;滴加熒光標(biāo)記二抗（1∶200）室溫濕盒避光孵育1 h;PBS洗3次，每次3～5 min;加DAPI室溫濕盒避光孵育5 min;PBS洗1次、去離子水洗2次，每次3～5 min;抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下觀察、拍片。

2 結(jié) ?果

2.1 最佳轉(zhuǎn)染效率的篩選及表達時效的觀察

通過熒光電鏡觀察轉(zhuǎn)染熒光強度及光鏡下觀察細胞形態(tài)與數(shù)目顯示，MOI為100時轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染第6天時，轉(zhuǎn)染效率可達到82.9%（圖1）;綠色熒光表達陽性細胞比例隨細胞傳代次數(shù)的增加，有逐漸減少趨勢，但趨勢不明顯，至培養(yǎng)第90天時，綠色熒光蛋白表達陽性細胞比例約為69.5%。兩對照組髓核細胞傳到第5代時，生長速度變得緩慢，光鏡下觀察細胞突起延長，呈梭形，胞質(zhì)逐漸減少，折光性較差;傳至第6代時，細胞演變?yōu)殚L梭形，生長滯緩，并出現(xiàn)老化現(xiàn)象。而pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組細胞傳至第15代時，光鏡下觀察髓核細胞仍呈多角形、短梭形，細胞形態(tài)飽滿、胞漿豐富，形態(tài)正常，細胞代謝旺盛，增殖能力較強，與未轉(zhuǎn)染病毒的前3代髓核細胞形態(tài)無明顯差異。截止到撰稿時建立的永生化髓核細胞系已傳代25代，髓核細胞的形態(tài)與活性狀態(tài)良好。

2.2 各組hTERT基因表達水平

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，兩對照組的目的基因不表達，而pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染后的第7、15、30、60、90天均可檢測到hTERT基因表達，在轉(zhuǎn)染第15天后hTERT基因處于較穩(wěn)定的高表達狀態(tài)。pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后第15、30、60、90天的hTERT基因表達水平顯著高于轉(zhuǎn)染后第7天（F=65.7，P<0.05），而第15、30、60、90天時的表達水平差異無顯著意義（P>0.05）。見圖2。細胞免疫熒光檢測結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果一致，即對照組髓核細胞無hTERT的表達，pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組髓核細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均可以檢測到hTERT的表達。

2.3 hTERT基因?qū)λ韬思毎铣杉毎饣|(zhì)影響

RT-PCR檢測的結(jié)果顯示，pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組細胞的蛋白多糖及Ⅱ型膠原基因表達水平較兩對照組均明顯增高（F=173.5、111.1，P<0.05），而兩對照組之間差異則無顯著意義（P>0.05）。轉(zhuǎn)染第15天后，隨著hTERT基因的穩(wěn)定高表達，pLVX-hTERT轉(zhuǎn)染組髓核細胞中蛋白多糖及Ⅱ型膠原基因表達水平也達到較穩(wěn)定的高表達狀態(tài)，各轉(zhuǎn)染組之間差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

3 討 ?論

目前，利用組織工程的方法進行髓核細胞移植治療椎間盤退行性變疾病已成為脊柱領(lǐng)域研究的新方向，但是髓核細胞的活性較低，并且隨著傳代次數(shù)的增加，細胞出現(xiàn)反分化現(xiàn)象，細胞的生物活性降低，這些限制了髓核細胞移植的相關(guān)研究進行。建立具有高活性且沒有去分化現(xiàn)象的髓核細胞系，是解決髓核細胞種子不足的有效途徑。目前已證實多種病毒或基因可以有效促進細胞永生化，例如乳頭瘤病毒E6和E7、猿猴病毒的大T抗原40（SV40）、反轉(zhuǎn)錄病毒E1A、人T細胞白血病病毒、EB病毒、皰疹病毒和hTERT等[7-9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，癌基因c-myc等也可使細胞具有永生化的能力，但其成瘤性較強[10]。上述基因中，SV40和hTERT在建立人永生化髓核細胞系方面優(yōu)勢更為明顯。SV40基因可使哺乳動物及人源多種組織細胞逃逸衰老和增殖危機，因此具有使培養(yǎng)細胞永生化的能力[11]。SAKAI等[12]將取自1例19歲男性爆裂性腰椎骨折病人的髓核進行體外培養(yǎng)，以SV40轉(zhuǎn)染髓核細胞，結(jié)果顯示被轉(zhuǎn)染的細胞生物活性較高，細胞凋亡比例明顯降低，并且較長時間處于分裂增殖狀態(tài)，傳代至40代后仍能保持髓核細胞的生物學(xué)特性。

端粒是真核細胞染色體末端的能夠抑制染色體末端融合或被降解、維持染色體穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)，與細胞的增殖有關(guān)。在正常情況下，細胞每分裂1次，端粒DNA會縮短50～200 bp，當(dāng)端?？s短到一定程度后即引起細胞衰老、死亡[13]。人端粒酶主要由端粒酶相關(guān)蛋白、端粒酶RNA及具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的hTERT構(gòu)成，其中hTERT表達水平?jīng)Q定了端粒酶的活性[14]。hTERT可以自身RNA為模板合成端粒DNA并加到染色體末端，彌補細胞分裂時丟失的序列。有研究表明，將hTERT基因轉(zhuǎn)染到正常細胞中，可以增強端粒酶的活性，延長端粒長度，細胞可以越過危機期而發(fā)生永生化[15]。學(xué)者們已經(jīng)在多種細胞中進行了驗證，證實hTERT基因能夠延長細胞的生命并且能維持細胞的功能[16]。KIYONO等[17]研究表明，hTERT在pRb或p16滅活的情況下能提高致人細胞永生化的效率。本實驗通過慢病毒載體將hTERT基因成功導(dǎo)入體外培養(yǎng)的正常人椎間盤髓核細胞，并證實hTERT基因能在髓核細胞內(nèi)正確表達，細胞外基質(zhì)的表達量也相應(yīng)增加，轉(zhuǎn)染后傳代10代的髓核細胞形態(tài)保持正常髓核細胞的特征，沒有出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，到目前為止細胞傳代25代，生長狀態(tài)良好。CHUNG等[18]以脂質(zhì)體為載體將hTERT成功轉(zhuǎn)染入牛椎間盤髓核細胞，證實hTERT基因具有延長髓核細胞壽命及增強其功能的作用，但不能持久穩(wěn)定表達目的基因。而本研究以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染髓核細胞，有效地彌補了hTERT基因不能長期在髓核細胞中穩(wěn)定表達的缺陷。LIANG等[19]的研究結(jié)果也顯示，hTERT基因的高表達可以提高髓核細胞復(fù)制增生能力，降低髓核細胞凋亡率。

目前研究表明，不同時期的髓核細胞的蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白表達量隨細胞體外傳代次數(shù)的增加而明顯減少，在基因分子表達水平上呈現(xiàn)去分化生長趨勢[20]。本實驗將hTERT基因成功導(dǎo)入第2代正常髓核細胞后，經(jīng)RT-PCR證實，轉(zhuǎn)染目的基因的髓核細胞的蛋白聚糖及Ⅱ型膠原表達水平較未轉(zhuǎn)染目的基因的對照組顯著增高，且能較長時間維持這一水平。吳劍宏等[21]研究表明，hTERT基因?qū)φＫ韬思毎|(zhì)的表達有正調(diào)控的作用，與本實驗結(jié)果基本相符。本實驗光鏡下觀察結(jié)果顯示，傳代10代后的細胞形態(tài)飽滿、胞漿豐富，細胞呈多角形、短梭形，細胞形態(tài)與前3代的正常髓核細胞無明顯差異，表明永生化髓核細胞系成功建立。

為解決移植于椎間盤的細胞來源稀少等問題，IWASHINA等[22]在體外培養(yǎng)的健康人髓核細胞中，利用腺病毒載體介導(dǎo)SV40而獲得永生化人髓核細胞系，并將具有永生化能力的細胞成功移植到退變的兔椎間盤模型中，證明人髓核細胞的移植能夠延緩?fù)米甸g盤的退變，為臨床生物治療腰椎退行性變疾病提供了新思路。

綜上所述，本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上成功建立了具有永生化能力的髓核細胞系，解決了髓核細胞來源不足的問題，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因與動物實驗提供了優(yōu)質(zhì)的種子細胞。

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（本文編輯 馬偉平）