鐘秀波 繆繼東 李家偉 王 剛

(自貢市第四人民醫(yī)院腫瘤科，自貢 643000)

骨肉瘤是一種多發(fā)于兒童和青少年的惡性腫瘤，其具有高轉移率并且病情進展快速、致死率高等特征，因此導致骨肉瘤患者臨床治愈率差[1,2]。骨肉瘤是骨科最難治療的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展過程復雜，往往伴隨著炎癥因子的釋放和癌細胞、淋巴結轉移[3,4]。目前有研究表明骨肉瘤發(fā)生的分子機制可能與腫瘤免疫有關，多種腫瘤免疫相關蛋白均參與了腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲等過程，而腫瘤免疫信號通路又與多種磷酸激酶相互作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到不同的作用[1，5，6]。目前臨床上常用的骨肉瘤化療藥物順鉑具有一定的副作用，例如腎毒性和嚴重的嘔吐，因此針對順鉑臨床應用，降低其臨床使用劑量具有一定的臨床意義[7]。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，白花蛇舌草素作為一味傳統(tǒng)中藥具有增強免疫功能和抗腫瘤作用[8]。本研究采用順鉑聯合白花蛇舌草素體外給藥處理骨肉瘤細胞，觀察藥物聯合作用對骨肉瘤惡性生物學行為的影響及潛在的機制，為臨床上順鉑和白花蛇舌草素的聯合用藥提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1患者來源 本研究共納入2017年1月～2018年10月自貢市第四人民醫(yī)院收治的63例骨肉瘤患者和同期63例骨肉瘤患者正常組織。納入標準：①所有患者均首次來院就診，并且經過病理檢驗科診斷證實，均未經過任何治療；②無傳染病和血液傳染?。虎蹆山M性別、年齡的差異無統(tǒng)計學意義，且均無其他骨病或系統(tǒng)性疾病。排除標準：①患有嚴重傳染性疾病；②對醫(yī)囑依從性差，無法配合研究者；③合并用藥嚴重感染、心腦血管疾病以及肝腎功能嚴重障礙者。本研究獲得自貢市第四人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.1.2試劑 骨肉瘤細胞系MG-63和Saos-2購自中國科學院上海細胞庫；白花蛇舌草素(SX20190124)購自四川省食品藥品檢驗院；順鉑購自Sigma公司(P4394)、蛋白定量試劑盒(P503021-0500)、SDS凝膠試劑盒(P0012A)、細胞裂解液(P0013)、結晶紫(P8470-25g)均購自上海吉瑪生物有限公司；DMEM(SH30021)、胎牛血清(SH30406)、胰蛋白酶消化液(SV30042)購自美國 HyClone；青鏈霉素混合液(P1400)、4%多聚甲醛(P1110)、苯胺藍(28631-66-5)和蘇木素(C0107)均購自武漢依科有限公司，β-actin(ab179577)、SRPK1(ab346089)和兔二抗(ab150077)購自英國Abcam。PrimeScriptTMRT試劑盒(R0047A)和SYBR(RR1297)購自中國TaKaRa。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 石蠟切塊進行脫蠟和水化處理，抗原修復后滴加封閉液；1∶500稀釋HGF一抗孵育；孵育結束后用PBS進行沖洗，加生物素標記的二抗進行孵育；PBS再次沖洗，滴加鏈親和素-過氧化酶溶液孵育。次日DAB顯色液顯色，蘇木素染液復染，中性樹脂膠固封；PBS作為一抗陰性對照組，陽性細胞著色為棕黃色。

1.2.2CCK-8實驗 調整MG-63和Saos-2細胞數為 4×105個/孔，Control組細胞直接鋪板，Cisplatin組細胞貼壁后給藥1.5 μmol/L(Cisplatin)，Cisplatin+HD組細胞貼壁后給藥1.5 μmol/L(Cisplatin)+30 μg/ml(HD)，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1 d、2 d 和3 d。培養(yǎng)結束后每孔加入20 μl CCK-8，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內避光孵育2 h，室溫于搖床振蕩10 min。酶標儀490 nm波長處檢測同一時間點OD 值，用測得的OD值進行細胞增殖影響的分析。

1.2.3克隆形成實驗 細胞分組同1.2.2，細胞接種5 d后每孔各加500 μl胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。 貼壁生長15 d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結晶紫溶液染色15 min，PBS 輕輕沖洗細胞，室溫風干后計數多于50個細胞的克隆。

1.2.4qRT-PCR 細胞分組同1.2.2，培養(yǎng)箱設定37℃、5% CO2進行細胞培養(yǎng)36 h后收集細胞，向細胞中加入1 ml Trizol試劑以提取總RNA，嚴格按照PrimeScriptTMRT試劑盒的說明將RNA逆轉錄成cDNA，隨后加引物和SYBR Green。PCR反應程序如下：95℃ 5 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，40個循。每個樣本設3個復孔。使用β-actin作為參考標準，使用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達水平。引物序列如下：β-actin：F 5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′；R 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；SRPK1：F 5′-ATGCTTTCCTTCGACACCCGAT-3′；R 5′-TCCCTGGCGTCGACCAA-3′。

1.2.5Western blot 細胞分組同1.2.2，培養(yǎng)箱設定37℃、5% CO2進行培養(yǎng)細胞36 h后收集細胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min后高速離心(13 000 r/min)吸取蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PAGE電泳后轉膜，轉膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋β-actin、PI3K及p-Smad7，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加入兔二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.6RNA轉錄組測序 檢測RNA質量，首先用DNA酶Ⅰ處理RNA樣品防止樣品污染，隨后dT磁珠富集mRNA，再將mRNA片段化成短片段，合成cDNA的第一鏈，再進行末端修復和腺嘌呤添加。最后，將測序銜接子連接到片段上，通過PCR擴增富集片段。使用Agilent 2100 Bioanaylzer實時PCR系統(tǒng)對樣品庫進行鑒定和定量，通過Illumina HiSeqTM4000對文庫產物進行測序。比對數據用于計算參考基因的讀數分布和映射比率，進行下游分析，包括基因表達和基于基因表達的深度分析(PCA，相關性，篩選差異表達的基因等)。

2 結果

2.1白花蛇舌草素抑制骨肉瘤細胞的增殖 分別用0～40 μg/ml白花蛇舌草素處理體外骨肉瘤細胞，發(fā)現白花蛇舌草素對骨肉瘤細胞MG-63的抑制作用呈濃度依賴性，且作用3 d后 30 μg/ml白花蛇舌草素對骨肉瘤細胞的抑制作用最強，因此后續(xù)實驗以30 μg/ml為白花蛇舌草素作用濃度。見圖1。

2.2順鉑聯合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細胞的增殖能力 CCK-8(圖2A、C)和克隆形成實驗(圖2B、D)結果均表明，順鉑和白花蛇舌草素聯合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，其抑制作用明顯強于順鉑單獨給藥組，差異具有統(tǒng)計學意義，(P<0.05)。

2.3順鉑聯合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細胞的遷移能力 細胞劃痕實驗結果顯示順鉑和白花蛇舌草素聯合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的劃痕愈合能力，并且其抑制作用強于順鉑單獨給藥組(圖3A、B)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4順鉑聯合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細胞的侵襲能力 Transwell實驗結果顯示順鉑和白花蛇舌草素聯合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力，并且其抑制作用強于順鉑單獨給藥組(圖4A、B)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5白花蛇舌草素給藥后降低骨肉瘤細胞SRPK1

圖1 不同濃度白花蛇舌草素對MG-63細胞增殖能力的影響Fig.1 Effects of different concentratin Hedyotis diffusa on proliferation of MG-63 cellsNote: ***.P<0.001.

的表達 RNA-seq技術檢測順鉑給藥和聯合給藥組MG-63細胞給藥后各基因在RNA水平表達差異，結果發(fā)現腫瘤免疫相關蛋白SRPK1在聯合給藥后在MG-63細胞中下調明顯。推測白花蛇舌草素可能通過降低SRPK1的表達來增強順鉑的抑瘤作用，隨后在RNA(圖5A)和蛋白水平(圖5B)分別在MG-63和Saos-2細胞水平進行了驗證。結果發(fā)現SRPK1在順鉑和白花蛇舌草素聯聯合給藥組表達最低，且明顯低于順鉑單獨給藥組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 白花蛇舌草素增強順鉑抑制MG-63和Saos-2細胞增殖能力Fig.2 Hedyotis diffusa enhances ability of cisplatin to inhibit proliferation of MG-63 and Saos-2 cellsNote:A,C.CCK-8 test to detect the proliferation of MG-63 and Saos-2 cells by Hedyotisin combined with cisplatin;B，D.Clone formation test to test MG-63 and Saos-2 cell clone forming ability.**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 白花蛇舌草素增強順鉑抑制MG-63和Saos-2細胞劃痕愈合能力Fig.3 Hedyotis diffusa enhances ability of cisplatin to inhibit scratch healing of MG-63 and Saos-2 cellsNote:A.Scratch test to detect the healing of MG-63 cells in different treatment groups;B.Scratch test to detect healing of Saos-2 cells in different treatment groups.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 白花蛇舌草素增強順鉑抑制MG-63和Saos-2細胞侵襲能力Fig.4 Hedyotis diffusa fortunei enhances invasive ability of cisplatin to inhibit MG-63 and Saos-2 cellsNote:A.Trans-well test detects the invasion ability of MG-63 cells in different treatment groups;B.Transwell test detects the invasion ability of Saos-2 cells in different treatment groups.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 白花蛇舌草素聯合順鉑組MG-63細胞和Saos-2細胞SRPK1均表達降低Fig.5 Reduced expression of SRPK1 in MG-63 cells and Saos-2 cells of Hedyotis diffusa combined with cisplatin groupNote:A.RNA-seq differential gene heat map;B and C.qRT-PCR and western blot to detect SRPK1 expression in MG-63 cells in different treatment groups;D and E.qRT-PCR and Western blot to detect SRPK1 expression in Saos-2.**.P<0.01.

圖6 SRPK1在腫瘤組織和正常組織中的表達Fig.6 SRPK1 expression in tumor tissues and normal tissuesNote:***.P<0.001.

圖7 白花蛇色草素提高順鉑對PI3K/AKT/TOR信號通路抑制Fig.7 Hedyotis diffusa enhances inhibition of PI3K/AKT/TOR signaling pathway by cisplatinNote:A.KEGG analysis of enrichment of differential fund pathways;B.Western blot detection of PI3K/AKT/TOR signal-related protein expression in MG-63 cells of different treatment groups.**.P<0.01,***.P<0.001.

2.6SRPK1在骨肉瘤組織中的表達 免疫組化染色，結果發(fā)現與正常組織相比，骨肉瘤組織中SRPK1表達明顯較多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6)。

2.7白花蛇舌草素增強順鉑抑制PI3K/AKT/TOR信號通路作用 通過RNA-seq結果進行KEGG分析，結果表明白花蛇舌草素給藥處理后骨肉瘤細胞內SRPK1下調倍數最明顯，同時KEGGE分析結果顯示其與PI3K/AKT/TOR信號通路相關，因此qRT-PCR檢測不同處理組骨肉瘤細胞PI3K/AKT/TOR信號通路相關蛋白的變化，結果顯示順鉑可以有效抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化從而促進mTOR的表達，而白花蛇舌草素進一步加強抑制作用。見圖7。

3 討論

骨肉瘤因其具有高轉移和增殖能力，導致患者5年存活率較低[9]。臨床治療過程中骨肉瘤具有容易復發(fā)和治療效果不佳等特點[10]。順鉑是臨床治療骨肉瘤的常用化療藥物，具有一定的副作用[11]。隨著祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥研究的不斷深入，傳統(tǒng)中草藥對腫瘤的治療成為研究熱點。白花蛇舌草為一年生披散草本，其成藥味苦、淡，性寒，主要功效是清熱解毒、消痛散結、利尿除濕，尤善治療各種類型炎癥[12]。在臨床實踐中，發(fā)現白花蛇舌草素若配伍得當，可治療多種疾病[13]。目前研究表明其提取物可以通過刺激網狀內皮系統(tǒng)，增加白細胞吞噬功能以提高血清殺菌力，提高免疫功能，同時白花蛇舌草素在體內對白血病細胞如急性粒細胞白血病細胞、急性淋巴性白血病細胞有抑制作用[14]；白花蛇舌草素素對小白鼠腹水肝癌細胞有抑制、殺滅作用[15]。

研究順鉑聯合白花蛇舌草素對MG-63和Saos-2細胞增殖的影響，結果發(fā)現與空白對照組和順鉑單獨給藥組相比，聯合給藥組顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖作用，初步說明白花蛇舌草素和順鉑聯合給藥起到協(xié)同抑瘤作用。用細胞劃痕和Transwell實驗檢測聯合給藥對骨肉瘤細胞轉移和侵襲能力的影響，結果與增殖結果相似，聯合給藥組細胞不論是遷移能力還是侵襲能力均被顯著抑制，且抑制效果強于順鉑單獨給藥組。進一步證實了二者的協(xié)同抑瘤作用。

為了探討其可能的作用機制，使用RNA-seq技術檢測順鉑聯合白花蛇舌草素組和順鉑單獨給藥組之間差異基因在RNA水平的變化，結果顯示腫瘤免疫相關蛋白SRPK1在聯合給藥組中的表達明顯低于順鉑單獨給藥組，因此推測白花蛇舌草素可能是通過抑制SRPK1的表達從而起到協(xié)同抑瘤作用，隨后檢測了兩種骨肉瘤細胞MG-63和Saos-2經過不同給藥處理后SRPK1的表達，結果發(fā)現不論在MG-63細胞還是Saos-2細胞SRPK1在聯合給藥組的表達最低，與RNA-seq結果相吻合。除了在體外的檢測外，進一步在臨床腫瘤標本進行了免疫組化染色檢測SRPK1的表達，結果顯示SRPK1在骨肉瘤腫瘤組織中的表達顯著高于正常組織。說明SRPK1對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展起到促進作用，而白花蛇舌草素可以通過抑制腫瘤免疫相關蛋白SRPK1的表達與順鉑聯合給藥有效抑制了骨肉瘤細胞在體外的增殖、轉移和侵襲等一系列惡性生物學行為。

文獻報道通過敲低SOX2靶向抑制SRPK1介導的PI3K/AKT信號通路抑制皮膚基底細胞癌細胞的遷移和侵襲能力[16]；miR-216b 通過靶向SRPK1抑制大結腸癌的增殖、遷移和侵襲[17]；靶向作用SRPK-1的嵌合抗體可以抑制非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲[18]；microRNA-1296通過靶向SRPK1介導的PI3K/AKT途徑來抑制肝細胞癌的轉移和上皮-間質轉化[19]。而KEGG分析結果進一步顯示在骨肉瘤中白花蛇舌草素同樣作用于PI3K/AKT/TOR信號通路，蛋白分析結果進一步驗證了KEGG分析結果，白花蛇舌草素可以提高順鉑抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化的作用，從而抑制PI3K/AKT/TOR信號通路的激活。但是在骨肉瘤中PI3K/AKT/TOR信號通路與SRPK1的關系如何，對其腫瘤免疫機制的研究將成為下一步重點關注的研究熱點。