●周瑞娟 張秋萍 盧曉惠 文 娛 陳雪梅 陳雋鵬 徐樂勤

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占所有腫瘤的10.4%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。在我國，每年新發(fā)乳腺癌病例約26.9 萬，已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位[2]。尤其是近年來我國乳腺癌發(fā)病率快速上升，它已成為我國女性六大癌癥死亡原因之一[3]。據(jù)文獻報道，近50%的晚期乳腺癌患者有骨轉(zhuǎn)移，約70%乳腺癌死于骨轉(zhuǎn)移[4]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移可導致患者遭受骨痛、高血鈣、骨折、截癱以及惡病質(zhì)等痛苦，嚴重影響其生存期及生活質(zhì)量[5]。因此，探索具有防治或延緩乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、骨破壞的藥物具有極為重要的臨床意義。

在乳腺癌患者長期的綜合治療中，中醫(yī)藥的作用已經(jīng)得到廣泛肯定[6]。陸德銘教授[7]認為，乳腺癌病性本虛而標實，治療強調(diào)“養(yǎng)正積自除”，主張“扶正為主，祛邪為輔”，扶正固本為防止復發(fā)轉(zhuǎn)移的主要方法。扶正時尤重脾腎，若脾腎不足，則先后天平衡失調(diào)，致使正氣內(nèi)虛。臨床常選用黃芪、黨參、白術、茯苓、陳皮等益氣養(yǎng)血健脾和胃，扶助氣血、顧護后天，使氣血生化有源；選用淫羊藿、補骨脂、巴戟天、鹿角片等補益腎氣，調(diào)攝沖任，固攝先天，使先后天平衡，正氣得固，則邪氣易被殺滅或祛除，防止或延緩了骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[8，9]。唐漢鈞[10]認為，本病系毒邪內(nèi)攻入骨，肝腎虧損所致。也有學者[11]分析了近幾年中國學術期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)中治療骨轉(zhuǎn)移癌的內(nèi)服方劑，發(fā)現(xiàn)組方規(guī)律是以扶正補虛為基本治則，補骨脂、骨碎補、淫羊藿3味藥出現(xiàn)頻次最高。

因此，依據(jù)扶正固本的根本治則，本實驗選取具健脾補腎功效的中藥，擬定基本方（由黃芪、黨參、茯苓、淫羊藿、補骨脂等藥物組成），通過動物實驗探討扶正固本方藥減輕骨破壞的作用及其可能的分子機制，為中醫(yī)藥防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、骨破壞提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 試劑與藥品TRAP 染色試劑盒（購自Sigma 公司），細胞培養(yǎng)基DMEM、胰酶、胎牛血清、雙抗（購自Gibco 公司），TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、IGF ELISA試劑盒（購自ThermoFisher公司），PTHrP ELISA 試劑盒（購自默沙克公司），PDGF ELISA 試劑盒（購自R&D SYSTEMS 公司），唑來膦酸注射液（購自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司）。扶正固本方（黃芪30g、黨參15g、茯苓9g、淫羊藿30g、補骨脂30g）由廈門市中醫(yī)院中藥房提供。

1.2 實驗動物裸鼠（6～8周齡）購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于廈門大學SPF級動物中心。

1.3 細胞株人乳腺癌細胞MDA-MB-231-luc 購買于中國科學院上海細胞研究所。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞MDA-MB-231-luc以10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液DMEM，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 天換液一次，待細胞生長至80%～90%，采用0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)。造模當天，采用0.25%胰酶消化培養(yǎng)皿中的MDA-MB-231-luc 細胞，收集細胞懸液，經(jīng)800 rpm 離心5 min 后，將沉淀細胞用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2遍，血細胞計數(shù)器計數(shù)，采用PBS重懸，使細胞終濃度為5×104個/μl細胞懸液，置于冰上備用。

2.2 動物分組選取6～8周齡雌性裸鼠40只，每籠5 只，飼養(yǎng)于SPF 級動物中心，每三天清理鼠籠一次，直至實驗結(jié)束。購買到的裸鼠在動物中心適應性飼養(yǎng)3 天，確認其無烈性傳染病，并基本適應新的飼養(yǎng)環(huán)境后，開始下一步實驗。根據(jù)體重排序，采用隨機數(shù)字表法將裸鼠分為4 組，分別為空白對照組、模型組、唑來膦酸組和扶正固本組，每組10只。

2.3 脛骨內(nèi)注射乳腺癌細胞建立乳腺癌骨破壞動物模型所有裸鼠均被置于超凈工作臺中，采用2.5%的阿弗?。?.3～0.4）ml/20g 麻醉。待裸鼠麻醉后，沿髕骨前方作約1cm～2cm 縱形皮膚切口，沿髕韌帶邊緣作1cm 切口，暴露脛骨上緣。模型組、唑來膦酸組和扶正固本組這三組裸鼠均采用顯微注射器（規(guī)格：26G）向脛骨內(nèi)注射4×104個螢光素酶標記的MDAMB-231-luc 人乳腺癌細胞（總體積20μl）；空白對照組則采用顯微注射器向脛骨內(nèi)注射20μl PBS?？p合切口，將裸鼠置于37℃恒溫板上，待裸鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。

2.4 給藥方法扶正固本組每天灌胃以體表面積換算所得劑量組藥湯劑，為14.82g/kg體重[計算方法：小鼠的給藥量（g/kg）=成人劑量（g/kg）×（人的轉(zhuǎn)換因子/小鼠的轉(zhuǎn)換因子）]；唑來膦酸組皮下注射唑來膦酸，0.2mg/kg 體重；空白對照組和模型組每天只灌胃相應劑量的生理鹽水。各組均每周給藥3次，連續(xù)給藥28天。觀察裸鼠外觀及行為，拍照并記錄其體重變化。

2.5 小鼠活體成像根據(jù)裸鼠的體重，側(cè)腹腔注射相應劑量的Luciferase-D 熒光底物，5min 后將裸鼠置于麻醉箱氣體麻醉。將麻醉好的裸鼠置于IVIS?-200 動物活體熒光成像系統(tǒng)中熒光成像，觀察腫瘤的大小。

2.6 小鼠X線檢查為觀察乳腺癌引起的骨質(zhì)破壞程度，采用阿弗丁麻醉裸鼠后，將裸鼠置于柯達X 線成像系統(tǒng)中，拍照觀察乳腺癌骨轉(zhuǎn)移或骨內(nèi)注射后引起的骨質(zhì)破壞面積百分比（骨質(zhì)破壞面積百分比=骨破壞面積÷脛骨骨質(zhì)總面積×100%）。

2.7 血清ELISA檢測于末次給藥后2 h，用剪鑷快速摘除眼球取血，收集各組裸鼠的血液放入促凝管中，4℃下靜置1 h，室溫3000 rpm 離心5 min，分離血清，采用ELISA 陣列試劑盒檢測裸鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、OPG、TGF-β、IGF、PDGF 細胞因子的表達水平，以空白對照組為基礎值計算給藥后裸鼠血液中以上細胞因子的表達改變。具體操作根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行。

2.8 脛骨TRAP 染色麻醉處死裸鼠，取出脛骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24h后，經(jīng)0.5M的EDTA脫鈣10天，再經(jīng)梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡（即脫水至蠟處理），石蠟包埋，切成4μm 厚度切片，挑選包含骨髓腔的脛骨切片，按常規(guī)脫蠟至水后，采用TRAP染色試劑盒進行組織染色。

2.9 統(tǒng)計方法采用SPSS19.0 For Windows 軟件進行統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。先對各組數(shù)值變量進行正態(tài)性檢驗，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗；服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，進一步檢驗方差齊性。方差齊時多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析和LSD-t法檢驗；方差不齊時，多組數(shù)據(jù)間的比較采用Welch檢驗和Dunnett's T3法檢驗。

3 結(jié)果

3.1 扶正固本方對乳腺癌在骨環(huán)境中生長的影響根據(jù)各組裸鼠脛骨內(nèi)乳腺癌細胞的熒光值情況（見圖1A），繪制乳腺癌細胞的生長柱狀圖（見圖1B）。與模型組比，扶正固本組和唑來磷酸組對乳腺癌細胞在骨環(huán)境中的生長均產(chǎn)生不同程度的抑制作用。

3.2 扶正固本方對乳腺癌誘導骨破壞的影響根據(jù)各組裸鼠脛骨X-ray檢測結(jié)果（見圖2A），繪制骨破壞程度的柱狀圖（見圖2B）。與模型組比，扶正固本組和唑來磷酸組可減輕乳腺癌細胞引起的骨破壞。

圖1 各組裸鼠IVIS檢測結(jié)果

圖2 各組裸鼠脛骨內(nèi)X-ray檢測及骨破壞面積

3.3 扶正固本方對脛骨破骨細胞活性的表達的影響根據(jù)各組裸鼠脛骨切片的TRAP 染色檢測結(jié)果（見圖3A），繪制TRAP 陽性細胞數(shù)目的柱狀圖（見圖3B）。與模型組比，扶正固本組和唑來磷酸組對乳腺癌細胞引起的破骨細胞活化均有不同程度的抑制作用。

圖3 裸鼠脛骨TRAP染色及TRAP（+）細胞數(shù)目

3.4 扶正固本方對小鼠血清中細胞因子的表達的影響表1結(jié)果顯示，扶正固本組和唑來磷酸組炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表達水平明顯低于模型組，比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。表2 結(jié)果顯示，扶正固本組和唑來磷酸組的PTHrP、RANKL（促破骨細胞形成因子）的表達水平低于模型組（P＜0.05）；而OPG（抑制破骨細胞形成因子）的表達上升，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.001）。表3結(jié)果顯示扶正固本組和唑來磷酸組血清中細胞生長因子TGFβ、IGF、PDGF的表達低于模型組，比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。

表1 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17表達情況（）

表1 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17表達情況（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

表2 各組小鼠PTHrP、RANKL、OPG表達情況（）

表2 各組小鼠PTHrP、RANKL、OPG表達情況（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

表3 各組小鼠TGF-β、IGF、PDGF表達情況（）

表3 各組小鼠TGF-β、IGF、PDGF表達情況（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

4 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移屬中醫(yī)學“骨蝕”“骨瘤”“骨痹”“骨疽”等范疇。骨轉(zhuǎn)移癌可表現(xiàn)出局部腫塊堅硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不變、面色晦暗等臨床特征；其發(fā)生、發(fā)展與中醫(yī)的腎和脾關系密切[12]。《醫(yī)經(jīng)精義》曰：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也?！逼⒛I為互濟之臟，腎虛久不復，火不生土，必傷脾陽?！端貑枴の迮K生成》云“腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也”，說明脾腎對骨的充養(yǎng)具有重要作用。扶正固本方由黃芪、黨參、茯苓、淫羊藿、補骨脂組成，具有益氣健脾、補腎壯骨的作用。

正常的骨代謝是通過成骨細胞的成骨作用與破骨細胞的骨吸收作用進行調(diào)節(jié)，從而保持一種動態(tài)平衡[13]。當乳腺癌骨轉(zhuǎn)移后，乳腺癌細胞、成骨細胞、破骨細胞和骨基質(zhì)細胞共同參與骨微環(huán)境的改造。19世紀英國Paget提出的“土壤和種子”學說已得到廣泛認可，認為靶器官內(nèi)適宜血液中播散的腫瘤細胞生存微環(huán)境是腫瘤發(fā)生的必要條件[14]。目前許多研究證據(jù)表明，腫瘤轉(zhuǎn)移取決于骨微環(huán)境提供的生長支持和癌細胞對這一環(huán)境的適應能力[15]。骨微環(huán)境包括細胞外基質(zhì)和細胞，如成骨細胞、破骨細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、造血細胞等，這些細胞可以產(chǎn)生多種因子，促進腫瘤細胞生長和骨轉(zhuǎn)移進程，而乳腺癌細胞也釋放多種因子并與微環(huán)境內(nèi)細胞相互作用，進而造成對骨結(jié)構的破壞[16]。

首先，乳腺癌細胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 等炎癥因子，一方面刺激成骨細胞分泌RANKL，另一方面刺激單核細胞融合成破骨細胞。其中IL-6 在誘導腫瘤細胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨細胞生成、抑制成骨細胞分化中具有重要作用[17]；IL-1β能夠直接刺激破骨細胞的增殖，增強其活性，促進乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨質(zhì)吸收[18]。TNF-α 可以刺激IL-1β、IL-6 的產(chǎn)生，從而促進惡性腫瘤細胞增殖，并抑制其凋亡[19]，還可以抑制間充質(zhì)干細胞增殖，促進成熟的成骨細胞凋亡，加速骨轉(zhuǎn)移灶骨質(zhì)破壞[20]。因此抑制骨轉(zhuǎn)移灶中IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子的表達，可減輕骨損傷、保護骨組織。本實驗中，扶正固本組骨組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量均明顯低于模型組，提示扶正固本方藥可減少骨轉(zhuǎn)移癌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 的分泌，從而減輕促炎因子介導的骨損傷以及腫瘤細胞的增殖。

其次，乳腺癌細胞產(chǎn)生的PTHrP 是主要的破骨細胞激活因子[21]。在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過程中，起到促進骨轉(zhuǎn)移的作用[22]。PTHrP刺激成骨細胞或基質(zhì)細胞產(chǎn)生RANKL，RANKL 通過未成熟破骨細胞表面的RANK信號系統(tǒng)，刺激轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄，導致未成熟的破骨細胞分化為成熟的破骨細胞；并且同時抑制OPG的合成[22，23]。OPG是RANKL的無功能受體，它能與破骨細胞表面的RANK競爭性結(jié)合RANKL，在體內(nèi)、體外情況下均能抑制破骨細胞的成熟和活化。目前認為RANKL/OPG 的比例是破骨細胞活性的決定因素之一[24，25]。成骨細胞和破骨細胞之間失去平衡，促進骨吸收作用。在骨轉(zhuǎn)移過程中，OPG 的表達量會很低，PTHrP和RANKL 的表達量增加，這樣就促使骨轉(zhuǎn)移后骨破壞的發(fā)生。而當促進或抑制相關調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生時，就能夠在一定程度上抑制骨的轉(zhuǎn)移。藥理研究顯示，補腎壯骨中藥具有以下的作用：①激活腎臟中1-α 羥化酶，提高骨鈣調(diào)節(jié)激素1，25-(OH)2D3水平；②調(diào)節(jié)垂體-性腺軸或通過植物雌激素成分直接作用于受體而發(fā)揮雌激素樣作用；③減少破骨細胞的生成，抑制破骨作用；④上調(diào)OPG 的表達，下調(diào)RANKL的表達，促進破骨細胞凋亡，同時促進成骨細胞增殖和分化，起到調(diào)節(jié)骨吸收的作用[26，27]。本實驗通過ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)扶正固本方藥對破骨細胞形成的相關調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生了調(diào)控作用，可促進OPG的表達，抑制PTHrP、RANKL 的表達，從而抑制破骨細胞的形成。

再者，TGF-β、IGF、PDGF等細胞生長因子是調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的重要因素[28-30]。TGF-β 是骨代謝中關鍵的信號因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中能幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)控[31]，有利于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并可促進破骨細胞的增殖和分化[32]；骨是TGF-β的主要存儲場所，骨轉(zhuǎn)移溶骨破壞可釋放大量TGFβ，且乳腺癌細胞直接分泌TGF-β，TGF-β 通過調(diào)控TGF-β/Smads信號通路，調(diào)控破骨細胞活性的主要介導因子PTHrP 等的表達，加速骨質(zhì)流失[33]；抑制TGFβ及PTHrP的表達，可截斷骨損傷惡性循環(huán)，減少骨損傷[34]。在破骨細胞的骨吸收中，骨中IGF-1 的釋放能刺激乳腺癌細胞增殖與趨化，并抑制其凋亡。MDAMB-231細胞中的IGF-1受體的過表達顯著增加骨轉(zhuǎn)移率，而乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞的有絲分裂增加，凋亡減少。低表達IGF-1 受體則相反。破骨細胞的骨吸收導致骨中IGF-1的釋放，在刺激細胞增殖和趨化作用以及抑制轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，導致骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[35]。ELISA 結(jié)果顯示，扶正固本方藥可減少小鼠血清中細胞生長因子TGF-β、IGF、PDGF的表達水平。

綜上所述，扶正固本方藥可通過降低炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17）、細胞生長因子（TGFβ、IGF、PDGF）以及促破骨細胞因子（PTHrP、RANKL）的表達，增加OPG 的表達，從而減緩乳腺癌骨細胞在骨環(huán)境中的生長，以及減輕乳腺癌細胞所引起的骨破壞。