趙震震 馬丹妮 蔡金秀 曹少謙 張 鏡 戚向陽

(1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校食品學(xué)院，浙江 寧波 315100)

果蔬在加工貯藏中易發(fā)生酶促褐變[1]，而鈍化酶活性可以有效抑制褐變，減少酚類、維生素等營養(yǎng)功能成分的流失。熱處理是最常用的鈍酶方法，有研究表明熱處理在取得良好鈍酶效果的同時(shí)，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)易造成熱敏性成分的損失[2-3]。脈沖強(qiáng)光(intense pulsed light，IPL)是由脈沖強(qiáng)光裝置通過氙燈電離作用產(chǎn)生的一段覆蓋紫外到紅外(200 ～1 100 nm)的脈沖光譜，具有瞬時(shí)、低功耗、高能量、低熱量等特點(diǎn)[4]。自1996年被美國FDA 批準(zhǔn)應(yīng)用于食品加工以來，人們對IPL 的殺菌效果、機(jī)制，以及其對食品品質(zhì)的影響進(jìn)行了較多研究[5-7]，IPL 在食品加工領(lǐng)域的獨(dú)特優(yōu)勢逐漸被人們所認(rèn)識。據(jù)報(bào)道，IPL 主要通過光化和光熱作用對微生物細(xì)胞壁、核酸等結(jié)構(gòu)造成不可逆損傷，達(dá)到殺菌效果[8-9]，且在提高果蔬制品中總酚、維生素等功能營養(yǎng)物質(zhì)含量方面效果顯著[10-12]。但有關(guān)IPL鈍酶及相關(guān)機(jī)理方面的報(bào)道相對較少。王正東等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在pH 值3.2 條件下，500 J·cm-2IPL 處理7次可以鈍化54.7%的楊梅多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性；劉亮等[14]研究表明，與紫外線照射相比，IPL 處理鈍化水蜜桃PPO 活性的速度更快。在鈍酶機(jī)制方面，Pellicer 等[15-17]探討了IPL 對辣根過氧化物酶、蘑菇PPO 及多聚半乳糖醛酸酶活性及結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，IPL 處理能打斷蛋白分子間二硫鍵，改變蛋白疏水性，破壞蛋白二級和三級空間結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)展開松散。但對于IPL 處理后蛋白分子間是否會(huì)發(fā)生重組交聯(lián)，形成蛋白聚集體尚需進(jìn)一步研究。故本研究以PPO 為對象，考察IPL 處理對其活性和結(jié)構(gòu)特性的影響以及IPL 處理對蛋白分子交聯(lián)和聚集的影響，以期為IPL 在果蔬制品加工中的應(yīng)用及開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PPO(870 U·mg-1)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；左旋多巴(levodopa，L-DOPA，純度99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)，美國Sigma 公司；5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸[5，5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris、甘氨酸(Gly)，索萊寶科技有限公司； 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWS-Y1-D2 型脈沖強(qiáng)光殺菌試驗(yàn)臺，寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司；721G 可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用電器有限責(zé)任公司；DK-8D 數(shù)顯控溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；F-380 熒光分光光度計(jì)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；MOS-500 圓二色光譜儀，法國Biological 公司；PowerPacTMBasic 電泳儀及Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PPO 活性測定 參考王正東等[13]的方法，并稍作修改。分別用pH 值6.8 的0.05 mol·L-1磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液配制3 mmol·L-1的L-DOPA 底物溶液與0.4 mg·mL-1的PPO 酶溶液。反應(yīng)體系為2.8 mL 底物溶液加上0.2 mL 酶溶液，在475 nm 波長處測定吸光度值，每隔30 s 記錄一次，以吸光度值對反應(yīng)時(shí)間作圖，記錄呈良好線性關(guān)系的初始反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的吸光度值。定義每分鐘內(nèi)吸光度值變化0.001 為1 個(gè)酶活力單位，單位為U·min-1。IPL 對PPO 活性的影響用酶活殘存率來表示，根據(jù)公式計(jì)算:

1.3.1.1 IPL 能量對PPO 活性的影響 取5 mL PPO酶溶液于直徑90 mm 塑料培養(yǎng)皿中，使其均勻鋪滿皿底，然后置于脈沖裝置室內(nèi)氙燈正下方處，固定脈沖次數(shù)為30 次，脈沖板間距為12 cm，分別在100、200、300、400、500 J 脈沖能量下進(jìn)行IPL 處理，然后測定酶活性。

1.3.1.2 IPL 次數(shù)對PPO 活性的影響 取5 mL PPO酶溶液于直徑90 mm 塑料培養(yǎng)皿中，使其均勻鋪滿皿底，然后置于脈沖裝置室內(nèi)氙燈正下方處，固定脈沖能量為500 J，脈沖板間距為12 cm，分別在10、15、20、25、30 次脈沖次數(shù)下進(jìn)行IPL 處理，然后測定酶活性。

1.3.1.3 IPL 板間距對PPO 活性的影響取5 mL PPO 酶溶液于直徑90 mm 塑料培養(yǎng)皿中，使其均勻鋪滿皿底，然后置于脈沖裝置室內(nèi)氙燈正下方處，固定脈沖能量為500 J，脈沖次數(shù)為30 次，分別在9、12、15、18、21 cm 脈沖板間距下進(jìn)行IPL 處理，然后測定酶活性。

1.3.2 PPO 結(jié)構(gòu)特性測定 為了探究IPL 處理下PPO 失活的相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步考察了在脈沖能量500 J，脈沖板間距12 cm，脈沖次數(shù)分別為0、20、40、60、80條件下，PPO 表面疏水性、游離巰基含量、內(nèi)源熒光強(qiáng)度等蛋白結(jié)構(gòu)特性的變化。

1.3.2.1 表面疏水性測定 采用ANS 熒光探針法[18]。用PBS 緩沖液將IPL 處理過的PPO 樣品溶液稀釋至0.01～0.10 mg·mL-1，然后取1 mL 稀釋樣液，向其中分別加入50 μL 8 mmol·L-1的ANS 熒光指示劑，渦旋混勻后于暗室靜置10 min，然后利用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，狹縫寬度5 nm，高壓700 Ⅴ，增益1，重復(fù)掃描3 次。以熒光強(qiáng)度對蛋白濃度作圖，所得良好線性關(guān)系直線斜率即為蛋白表面疏水性。

1.3.2.2 內(nèi)源熒光光譜掃描 參考邱春江[19]的方法。取0.2 mL IPL 處理過的PPO 樣品溶液于微量熒光比色皿中，利用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長293 nm，發(fā)射波長300 ～450 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫5 nm，掃描速度240 nm·min-1，高壓700 Ⅴ，增益1，重復(fù)掃描3 次。以PBS 緩沖液代替樣品作空白對照。

1.3.2.3 游離巰基含量測定 采用Ellman 法，參考貝君等[20]的方法，并稍作修改。分別添加2 mL Tris-Gly 緩沖液(1.04 g Tris、0.69 g Gly、0.12 g EDTA 用蒸餾水定容至100 mL)、0.2 mL Ellman 試劑(0.2 g DTNB 溶于50 mL 緩沖液)于1 mL IPL 處理過的PPO樣品溶液中，渦旋混勻后于室溫放置15 min，在412 nm 波長處測定吸光度值。按照公式計(jì)算巰基含量(sulfydryl，-SH，μmol·g-1):

式中，A412為412 nm 波長處的吸光度值；D 為樣品稀釋倍數(shù)；C 為樣品濃度，mg·mL-1。

1.3.2.4 SDS-PAGE 電泳 參考Laemmli[21]的方法。配制濃度5%的濃縮膠和濃度10%的分離膠，分別在還原和非還原條件下進(jìn)行。非還原條件下的蛋白上樣緩沖液中不含β-巰基乙醇。蛋白上樣量20 μL，Marker 上樣量3 μL。濃縮膠電泳電壓60 Ⅴ，分離膠電泳電壓120 Ⅴ。凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.2.5 圓二色光譜掃描 參考Kuznetsova 等[22]的方法。取0.2 mL IPL 處理過的PPO 樣品溶液于光程1 mm 的石英比色皿中，在190 ～250 nm 波長處利用圓二色光譜儀進(jìn)行掃描，以PBS 緩沖液為背景扣除本底，重復(fù)掃描3 次。掃描圖譜經(jīng)Bio-Kine 軟件平均殘基橢圓率單位轉(zhuǎn)換后，執(zhí)行Dicroprot 軟件中K2D 程序進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)含量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 軟件繪圖，SPSS Statistics 軟件進(jìn)行Duncan(D)方差分析，顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPL 處理對PPO 活性的影響

由圖1可知，PPO 酶活殘存率隨著脈沖能量和次數(shù)的增加及脈沖板間距的減小不斷降低，在脈沖能量500 J、脈沖30 次、脈沖板間距9 cm 條件下，PPO 酶活殘存率不足40%。

圖1 IPL 處理對PPO 酶活殘存率的影響Fig.1 Effect of IPL treatment on residual activity rate of PPO

2.2 IPL 處理對PPO 結(jié)構(gòu)特性的影響

2.2.1 表面疏水性 表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要特性之一，其在蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的發(fā)揮方面具有重要作用[19，23]。由圖2可知，隨著IPL 處理次數(shù)的增加，PPO 表面疏水性顯著增強(qiáng)。

圖2 IPL 處理對PPO 表面疏水性的影響Fig.2 Effect of IPL treatment on surface hydrophobicity of PPO

2.2.2 內(nèi)源熒光光譜掃描 內(nèi)源熒光光譜通常用于蛋白三級結(jié)構(gòu)的檢測。由圖3和表1可知，未進(jìn)行IPL 處理時(shí)，在338 nm 波長處發(fā)射出最強(qiáng)熒光，隨著IPL 處理次數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度不斷降低，當(dāng)IPL 處理次數(shù)達(dá)到80 次時(shí)，熒光強(qiáng)度降低約70%，而此時(shí)最佳發(fā)射波長也紅移至344 nm，可見IPL 處理后PPO 三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖3 IPL 處理PPO 內(nèi)源熒光光譜掃描圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of PPO by IPL treatment

表1 IPL 處理對PPO 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Table1 Effect of IPL treatment on the peak and fluorescence intensity of PPO

2.2.3 游離巰基含量 巰基是存在于半胱氨酸中的一種活潑基團(tuán)，可以氧化形成二硫鍵，維持蛋白立體空間結(jié)構(gòu)。由圖4可知，隨著IPL 處理次數(shù)的增加，PPO游離巰基含量顯著增加，在IPL 處理20、40、60、80 次后PPO 游離巰基含量分別由58.73 μmol·g-1顯著上升至60.20、61.95、62.78、63.79 μmol·g-1。

圖4 IPL 處理對PPO 游離巰基含量的影響Fig.4 Effect of IPL treatment on free sulfhydryl content of PPO

2.2.4 SDS-PAGE 分析 為了進(jìn)一步了解IPL 處理對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，分別對IPL 處理后的蛋白樣品進(jìn)行還原性和非還原性電泳試驗(yàn)。非還原條件下，電泳體系中SDS 能打斷蛋白分子間非共價(jià)鍵，使得通過非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白亞基相互分離，但由于未引入還原劑β-巰基乙醇，無法分離通過二硫鍵結(jié)合的蛋白亞基；還原條件下，由于β-巰基乙醇的作用，蛋白分子內(nèi)及分子間的二硫鍵被打斷，致使蛋白電泳行為主要受分子量大小影響。因而，通過對比還原和非還原條件下電泳圖可以分析蛋白共價(jià)聚集情況[24]。在非還原條件下，IPL 處理前后PPO 分別在70 kDa 和25 kDa產(chǎn)生一條重鏈(α 鏈)和一條輕鏈(β 鏈)；而在還原條件下，IPL 處理前后PPO 除產(chǎn)生一條重鏈(a 鏈)和一條輕鏈(d 鏈)外，還在48 kDa 和50 kDa 產(chǎn)生兩條中間分子量蛋白條帶(b、c 鏈)，表明非還原條件下α 鏈的蛋白聚集主要是二硫鍵共價(jià)結(jié)合的結(jié)果。此外，隨著IPL 處理次數(shù)的增加，a、b、c、d 及α 鏈條帶亮度逐漸降低，且在IPL 處理80 次后，α 鏈條帶基本消失，表明PPO 蛋白受IPL 處理的影響發(fā)生了降解[25]。

2.2.5 圓二色光譜掃描 圓二色光譜掃描是研究蛋白二級結(jié)構(gòu)常用的一種方法。蛋白質(zhì)4 種主要的結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲在不同波長下有不同的特征吸收峰，通常認(rèn)為208 nm 和222 nm 波長處的兩處負(fù)峰為α-螺旋結(jié)構(gòu)特征吸收峰[26]，峰值大小表示結(jié)構(gòu)含量的高低。由圖6可知，未進(jìn)行IPL處理時(shí)，在210 nm 和220 nm 波長處有兩處明顯的負(fù)吸收峰，但隨著IPL 處理次數(shù)的增加，210 ～230 nm 波長范圍內(nèi)平均殘基橢圓率不斷降低，峰也逐漸變得平緩，且210 nm 峰位向左藍(lán)移，說明IPL 處理改變了PPO 二級結(jié)構(gòu)，使得α-螺旋含量下降[22]。結(jié)合表2中K2D 程序分析的PPO 二級結(jié)構(gòu)含量變化可知，與未處理組相比，當(dāng)IPL 處理20、40、60、80 次后，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量分別下降了8、14.67、17、21 個(gè)百分點(diǎn)，相反，β 型結(jié)構(gòu)分別上升了9、15.66、17.33、21.33 個(gè)百分點(diǎn)，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量幾乎不變。

表2 IPL 處理對PPO 二級結(jié)構(gòu)含量的影響Table2 Effect of IPL treatment on the content of PPO secondary structure /%

圖5 IPL 處理PPO 凝膠電泳圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of PPO by IPL treatment

圖6 IPL 處理PPO 圓二色光譜掃描圖Fig.6 CD spectra of PPO by IPL treatment

3 討論

本研究結(jié)果表明，增加單次脈沖能量及脈沖次數(shù)或降低脈沖間距均能降低PPO 活性。通過分析PPO蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，IPL 處理使蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，引起表面疏水性增加[27]。而且該結(jié)果通過內(nèi)源熒光強(qiáng)度測定進(jìn)一步得到驗(yàn)證。色氨酸是組成蛋白質(zhì)的一種疏水性氨基酸，當(dāng)其在蛋白質(zhì)內(nèi)部時(shí)，具有較高的量子產(chǎn)率，293 nm 波長下可以激發(fā)出較強(qiáng)的熒光；但當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生去折疊反應(yīng)，色氨酸從蛋白內(nèi)部暴露出來時(shí)，量子產(chǎn)率開始下降，熒光強(qiáng)度也隨之下降[19，28]，因而可以作為內(nèi)源熒光探針檢測蛋白內(nèi)部疏水內(nèi)核微環(huán)境的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著IPL 處理次數(shù)的增加，內(nèi)源熒光強(qiáng)度不斷降低，最佳發(fā)射波長逐漸紅移，表明PPO 蛋白結(jié)構(gòu)展開，色氨酸更多地從蛋白內(nèi)部暴露出來，所處環(huán)境極性上升。前人研究也表明IPL 處理能降低蘑菇PPO[16]及多聚半乳糖醛酸酶[17]的色氨酸熒光強(qiáng)度。

二硫鍵由巰基氧化而成，其作為一種共價(jià)鍵對維持蛋白肽鏈三級空間結(jié)構(gòu)起著重要作用。當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)構(gòu)展開時(shí)，通常伴隨著二硫鍵的斷裂[29]。由表面疏水性及熒光強(qiáng)度試驗(yàn)結(jié)果可知，由于蛋白結(jié)構(gòu)展開松散，蛋白分子間的二硫鍵斷裂，釋放巰基，從而引起巰基含量升高。而非還原條件下電泳圖中沒有新的蛋白條帶形成，也表明IPL 處理破壞的主要是蛋白亞基內(nèi)的二硫鍵，對蛋白亞基間的二硫鍵影響較小。此外，由非還原條件下電泳結(jié)果可知，β 鏈條帶亮度隨著IPL 處理次數(shù)的增加不斷增加，原因可能是PPO 蛋白降解形成的小分子多肽、氨基酸等物質(zhì)的巰基發(fā)生氧化，誘導(dǎo)二硫鍵形成，促使蛋白交聯(lián)聚集。這種蛋白降解、結(jié)構(gòu)重組并引發(fā)交聯(lián)聚集的現(xiàn)象通常認(rèn)為是蛋白氧化的結(jié)果[30-31]。這與Wu 等[32]的研究結(jié)果一致，其通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，近紫外光能打斷二硫鍵，增加巰基含量，但也誘導(dǎo)了新的二硫鍵形成；Siddique 等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，IPL 處理能打斷二硫鍵，促使二聚體解離，同時(shí)誘導(dǎo)18.4 kDa 和14.2 kDa 蛋白分子形成二硫鍵，引起蛋白交聯(lián)聚集。

此外，蛋白二級結(jié)構(gòu)變化的分析結(jié)果表明，IPL 處理破壞了蛋白二級結(jié)構(gòu)，隨著IPL 處理次數(shù)的增加，PPO 二級結(jié)構(gòu)α-螺旋和β 型結(jié)構(gòu)含量分別呈現(xiàn)顯著降低和升高，這與Pellicer 等[15]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，IPL 處理能夠鈍化PPO 活性，且鈍化效果隨著單次脈沖能量和脈沖次數(shù)的增加，以及脈沖板間距的減小逐漸增加。而PPO 失活原因可能與IPL 處理破壞二級和三級結(jié)構(gòu)，使得蛋白結(jié)構(gòu)展開，并氧化降解有關(guān)。本研究為揭示IPL 鈍化PPO 活性機(jī)理及其在果蔬加工中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。