徐君怡， 楊莉莉， 羅 佳， 白景蓮， 劉玥婷, 趙 宇， 鄭秋月

(大連海關(guān) 技術(shù)中心，遼寧 大連 116001)

中國(guó)是大豆原產(chǎn)國(guó)，具有約5 000 a栽培歷史[1].大豆不僅是人類主要的油料作物和植物性蛋白來(lái)源，而且是重要的工業(yè)原料，在糧食安全及國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[2].

大豆種子中的蛋白質(zhì)含量和油分含量占其干重的60%以上，其中,蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上[3].隨著人們生活水平的提高，對(duì)大豆的需求日益增強(qiáng)，但是大豆是一種“土地密集型”產(chǎn)品，一年一熟.我國(guó)人多地少，在這類產(chǎn)品上不具有優(yōu)勢(shì)[4].與玉米、水稻等禾谷類作物相比，大豆絕對(duì)產(chǎn)量很低，如按能量轉(zhuǎn)換計(jì)算，大豆產(chǎn)量只有玉米的1/3.加上大田除草等工作量大，導(dǎo)致大豆比較效益低，制約大豆種植.考慮到資源稟賦的原因，我國(guó)大豆主要依靠國(guó)外市場(chǎng)[5].中國(guó)大豆進(jìn)口量占全球大豆貿(mào)易量的60%.據(jù)海關(guān)總署2020年1月14日發(fā)布數(shù)據(jù)，2019年12月中國(guó)大豆進(jìn)口量為954.3萬(wàn)t，同比飆升67%.

從全球首例抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆誕生以來(lái)[6],很多轉(zhuǎn)基因作物性狀都批準(zhǔn)上市, 包括抗除草劑性狀、抗蟲性狀等.但是現(xiàn)代育種的發(fā)展對(duì)轉(zhuǎn)基因作物性狀的要求也越來(lái)越高,傳統(tǒng)的單性狀已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的要求,于是就誕生了聚合兩種或者多種轉(zhuǎn)基因性狀的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物.復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物是指含有2個(gè)或者多個(gè)轉(zhuǎn)基因性狀的轉(zhuǎn)基因植株[7].目前，中國(guó)還沒有建立復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的評(píng)價(jià)體系.現(xiàn)批準(zhǔn)的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物完全按照單一性狀轉(zhuǎn)基因作物的審批流程進(jìn)行, 在所有國(guó)家和地區(qū)中是最嚴(yán)格的.在檢測(cè)技術(shù)上，與傳統(tǒng)單一性狀轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)在還不夠成熟, 還沒有一套完整的檢測(cè)技術(shù)體系，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測(cè).另外,對(duì)復(fù)雜混合樣品中復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的定量還缺少系統(tǒng)深入的研究.

轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增加，這可能有助于減輕全球饑餓和營(yíng)養(yǎng)不良問題.但是為了確保轉(zhuǎn)基因作物帶來(lái)的效益不僅僅滿足當(dāng)前需求，還能夠持續(xù)下去、符合未來(lái)利益，需要以科學(xué)為基礎(chǔ)，采取謹(jǐn)慎的、前瞻性的監(jiān)管措施，從環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展的角度關(guān)注農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力[8].

根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示[9]，在所有的商品化的轉(zhuǎn)基因作物中，轉(zhuǎn)基因大豆共有41個(gè)品系.其中，中國(guó)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)或用作加工原料的大豆品系17種.本文對(duì)大豆樣品進(jìn)行篩查檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)多品系混雜的大豆樣品.為了進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因大豆品系，采用實(shí)時(shí)熒光定性PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性的篩查檢測(cè)，對(duì)未批準(zhǔn)進(jìn)境或不符合生物安全證書的轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行排查.

1 材料與方法

大豆標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM或美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)AOCS，包括轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2(ERM-BF410dk、ERM-BF410ep)、DP356043(ERM-BF425d)、DP305423(ERM BF426d)、DAS68416-4(ERM-BF432d)、A5547-127(AOCS 0707-C3)、MON89788(AOCS 0906-B2)、A2704-12(AOCS 0707-B11)、MON87701(AOCS 0809-A)、CV127(AOCS 0911-D)、MON87705(AOCS 0210-A)、MON87769(AOCS 0809-B)、FG72(AOCS 0610-A4)、MON87708(AOCS 0311-A)、DAS-81419-2(ERM-BF437e)、DAS-44406-6(ERM-BF436e)、MON87751(AOCS 0215-A)，以及非轉(zhuǎn)基因大豆(AOCS 0906-A、AOCS 0911-A).檢測(cè)樣品為實(shí)驗(yàn)室留存的大豆樣品.

1.1 基因組核酸提取

實(shí)驗(yàn)材料放入液氮中研磨.采用TaKaRa公司的DNA extraction kit of genetically modified organism (GMO) detection Ver2.0 (No. D9093;TaKaRa,Dalian, China)試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取.提取的基因組DNA溶于 100 μL Tris-EDTA (TE) 溶液中.純化后的DNA樣品用紫外分光光度計(jì)(ND-1000;NanoDrop,Wilmington, DE)測(cè)定濃度.

1.2 檢測(cè)方法

采用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)方法SN/T 1204—2016[10]中大豆品系特異性的引物探針進(jìn)行定性檢測(cè).首先采用轉(zhuǎn)基因大豆篩選檢測(cè)基因pCaMV35S、pFMV35S、tNOS、BAR、PAT、GOX、CP4-EPSPE、CTP2-CP4-EPSPS、tE9進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的篩選檢測(cè).對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆篩選檢測(cè)基因陽(yáng)性的樣品，進(jìn)行SYHTOH2、DP68416-4、FG72、GTS40-3-2、MON87751、DAS44406、DAS81419-2、MON87708、MON87769、MON87705、CV127、MON87701、DP305423、DP356043、A5547-127、MON89788、A2704-12等17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè).

對(duì)于同時(shí)檢出2個(gè)以上品系陽(yáng)性的樣品，采用單粒多靶點(diǎn)的檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)合品系的確認(rèn).即取1粒轉(zhuǎn)基因大豆種子，按照1.1的方法進(jìn)行基因組核酸的提取.然后采用SN/T 1204—2016的大豆品系特異性引物探針進(jìn)行定性檢測(cè),檢測(cè)的引物探針序列見表1.

為了盡可能地避免低濃度混雜造成的檢測(cè)結(jié)果誤差,對(duì)再次選取的1粒轉(zhuǎn)基因大豆種子，采用先流水沖洗,然后在純水中浸泡2 h的方法洗凈雜質(zhì), 按照1.1的方法進(jìn)行基因組核酸的提取.采用單粒多靶點(diǎn)的檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)合品系的確認(rèn).

表1 轉(zhuǎn)基因大豆品系實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用引物和探針

表1(續(xù))

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆樣品品系篩查檢測(cè)

對(duì)2個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆篩選檢測(cè)基因陽(yáng)性樣品，進(jìn)行品系篩查檢測(cè)，結(jié)果如表2所示.1號(hào)大豆樣品檢出了GTS40-3-2、MON87708、MON89788等3種轉(zhuǎn)基因大豆品系；2號(hào)大豆樣品檢出了MON87708、MON89788、A2704-12等3種轉(zhuǎn)基因大豆品系.擴(kuò)增結(jié)果見圖1和圖2.陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果正常.

表2 2份大豆樣品17個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品系篩查檢測(cè)結(jié)果

圖1 1號(hào)大豆樣品17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè)結(jié)果

圖2 2號(hào)大豆樣品17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè)結(jié)果

2.2 單粒種子樣品品系篩查檢測(cè)

對(duì)單粒種子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有個(gè)別基因的擴(kuò)增曲線信號(hào)很弱，Ct值也比較靠后.1號(hào)大豆單粒種子樣品檢出MON89788品系陽(yáng)性，MON87708和GTS40-3-2品系弱陽(yáng)性(35

2.3 單粒種子樣品水洗浸泡后品系篩查檢測(cè)

為了盡可能地避免低濃度混雜造成的檢測(cè)結(jié)果誤差,對(duì)再次選取的1粒轉(zhuǎn)基因大豆種子，先流水沖洗,再在純水中浸泡2 h的方法洗凈雜質(zhì), 然后進(jìn)行基因組核酸的提取.1號(hào)大豆單粒清洗種子樣品檢出MON89788品系陽(yáng)性.2號(hào)大豆單粒清洗種子樣品檢出MON89788和MON87708品系陽(yáng)性.由于是單粒種子DNA提取，2號(hào)大豆單粒清洗種子樣品判斷應(yīng)該是MON89788×MON87708復(fù)合品系.擴(kuò)增結(jié)果見圖5和圖6.陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果正常.

圖3 1號(hào)大豆單粒種子17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè)結(jié)果

圖4 2號(hào)大豆單粒種子17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè)結(jié)果

圖5 1號(hào)大豆單粒清洗種子17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè)結(jié)果

圖6 2號(hào)大豆單粒清洗種子17種轉(zhuǎn)基因大豆品系的篩查檢測(cè)結(jié)果

2.4 3次檢測(cè)結(jié)果的比較

對(duì)于3次擴(kuò)增結(jié)果Ct值的比較見表3.對(duì)于1號(hào)大豆樣品，第1次檢測(cè)用的是混合大豆樣品進(jìn)行基因組提取，因此陽(yáng)性基因擴(kuò)增信號(hào)都很強(qiáng)，Ct值也都<30個(gè)循環(huán).第2次檢測(cè)，用的是單粒種子樣品，但是沒有進(jìn)行清洗，可能存在其他品系的低水平混雜現(xiàn)象.1號(hào)大豆單粒種子檢出MON89788品系陽(yáng)性，在第1次混合樣品中檢出的GTS40-3-2、MON87708品系也能夠微弱檢出(35

對(duì)于2號(hào)大豆樣品，第1次檢測(cè)用的是混合大豆樣品進(jìn)行基因組提取，陽(yáng)性基因擴(kuò)增信號(hào)都很強(qiáng)，Ct值也都<30個(gè)循環(huán).第2次檢測(cè)，用的是單粒種子樣品，沒有進(jìn)行清洗，但因?yàn)槭荕ON89788×MON87708復(fù)合品系，擴(kuò)增信號(hào)依然很強(qiáng)，Ct值都<30個(gè)循環(huán).第3次經(jīng)過清洗的2號(hào)大豆單粒種子依然檢出MON89788和MON87708品系陽(yáng)性，驗(yàn)證了2號(hào)大豆單粒種子存在MON89788×MON87708復(fù)合品系的結(jié)論.由于取的是單粒種子，在第2次和第3次檢測(cè)中都沒有A2704-12品系的擴(kuò)增信號(hào).

根據(jù)3次的檢測(cè)結(jié)果推斷，1號(hào)大豆樣品可能是GTS40-3-2、MON87708、MON89788等3種轉(zhuǎn)基因大豆品系的混合物；2號(hào)大豆樣品可能是MON89788×MON87708復(fù)合品系和A2704-12等2種轉(zhuǎn)基因大豆品系的混合物.

對(duì)于復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)是世界性的難題，應(yīng)用較多的是單粒多重PCR法[11].這種方法將單粒的作物樣品進(jìn)行基因組提取, 用多重PCR對(duì)其DNA進(jìn)行擴(kuò)增,最后通過目的條帶的條數(shù)和位置確定是否為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物.近來(lái)，多重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)領(lǐng)域[12-15]，也為復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因品系篩查檢測(cè)帶來(lái)進(jìn)展.但是對(duì)于復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)目前還沒有一套完整的檢測(cè)技術(shù)體系.

根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示[9]，至今通過審核了41個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品系，其中，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆16種(表4).MON87708×MON89788是孟山都公司的轉(zhuǎn)基因供體的常規(guī)育種雜交與選擇產(chǎn)生的復(fù)合品系.復(fù)合疊加的商業(yè)性狀是除草劑抗性.目前，MON87708×MON89788品系僅在4個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)種植，分別為烏拉圭(2012)、哥倫比亞(2012)、日本(2014)和巴西(2017).批準(zhǔn)進(jìn)口作為飼料和加工原料的國(guó)家和地區(qū)有8個(gè)，分別為阿根廷(2018)、巴西(2010)、哥倫比亞(2012)、歐盟(2015)、日本(2014)、墨西哥(2013)、菲律賓(2017)和韓國(guó)(2012).中國(guó)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)或用作加工原料大豆品系17種，其中，包括A2704-12、A5547-127、CV127、DP305423、DP356043、GTS40-3-2、MON87701、MON87708、MON87769、MON89788、DAS-81419-2、DAS-DAS-44406-6-6、FG72、MON87705、SYHT0H2等15種單一性狀品系和DP305423×GTS40-3-2、MON87701×MON89788等2種復(fù)合性狀品系，而2號(hào)大豆樣品檢出的MON89788×MON87708復(fù)合品系是在中國(guó)未經(jīng)批準(zhǔn)的大豆品系.這一情況提醒我們，雖然單一品系的檢測(cè)結(jié)果是符合生物安全證書批準(zhǔn)清單要求的，但是存在惡意混雜不符合生物安全證書批準(zhǔn)清單的復(fù)合性狀品系的可能.隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的推廣以及商業(yè)化程度的加深，進(jìn)口大豆或市售大豆制品所含轉(zhuǎn)基因成分越來(lái)越復(fù)雜.大豆的進(jìn)口貿(mào)易量在逐年增加，這一惡意行為不僅會(huì)對(duì)國(guó)內(nèi)的生物安全造成極大的危害，對(duì)大豆的進(jìn)口貿(mào)易也造成無(wú)法估量的損失.因此，國(guó)內(nèi)的農(nóng)業(yè)安全監(jiān)管部門和海關(guān)檢疫部門都應(yīng)該引起高度的重視.

表3 3次擴(kuò)增結(jié)果的Ct值比較

表4 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆品系匯總表