王 鋒，陸 歡，范亞平，楊 斌，施 輝

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南通 226001)

國內(nèi)外對(duì)急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的研究集中在缺血再灌注、中毒、膿毒血癥3個(gè)方面。隨著大量新型藥物如抗腫瘤藥物、抗生素、造影劑等的應(yīng)用，藥物引起的AKI呈逐漸上升趨勢。順鉑是

一種細(xì)胞增殖抑制劑，廣泛用于實(shí)體腫瘤的治療。順鉑的抗腫瘤效率好，但同時(shí)具有明顯的劑量依賴性腎毒性，有效緩解順鉑的腎毒性可提高腫瘤患者的化療質(zhì)量。通過減少caspase-3的表達(dá)以達(dá)到對(duì)AKI的保護(hù)作用，在缺血再灌注模型中已經(jīng)得到驗(yàn)證[1]，但對(duì)順鉑所致AKI的研究，國內(nèi)鮮見。本研究通過探討caspase-3抑制劑對(duì)順鉑誘導(dǎo)的正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞(normal rat kidney tubular epithelial cell,NRK-52E)損傷的影響及其可能的作用機(jī)制，為臨床緩解順鉑腎毒性提供新的治療思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 NRK-52E細(xì)胞(南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科惠贈(zèng))；順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；caspase-3抑制劑、青鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered saline,PBS)(碧云天生物有限公司)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(美國THERMO公司)；Annexin V-異硫氰酸酯(fluoresceine isothiocyanate,FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞凍存液(凱基生物有限公司)；Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)-F12培養(yǎng)基(美國HYCLONE公司)；小牛血清(德國Capricorn Scientific公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 (1)對(duì)照組(12、24 h)：NRK-52E細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；(2)順鉑組(12、24 h)：①5 μmol/L順鉑亞組；②10 μmol/L順鉑亞組；③20 μmol/L順鉑亞組；(3)干預(yù)組-1(12、24 h)：①10 μmol/L caspase-3抑制劑+5 μmol/L順鉑亞組；②10 μmol/L caspase-3抑制劑+10 μmol/L順鉑亞組；③10 μmol/L caspase-3抑制劑+20 μmol/L順鉑亞組。(4)干預(yù)組-2(12、24 h)：①20 μmol/L caspase-3抑制劑+5 μmol/L順鉑亞組；②20 μmol/L caspase-3抑制劑+10 μmol/L順鉑亞組；③20 μmol/L caspase-3抑制劑+20 μmol/L順鉑亞組。

1.3 順鉑注射液及caspase-3抑制劑作用過程N(yùn)RK-52E細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后用含10%小牛血清、1%青鏈霉素溶液的DMEM-F12完全培養(yǎng)液5 mL于25 cm透氣瓶37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)2～3 d傳代，培養(yǎng)至80%以上后，用0.25%胰酶(含EDTA)進(jìn)行消化并傳代培養(yǎng)。傳至第3代，將NRK-52E細(xì)胞以5×105/孔濃度接種于6孔板，每孔加完培至2.5 mL總?cè)芤?。?duì)照組(12、24 h)；順鉑組(12、24 h)各3個(gè)亞組；干預(yù)組-1(12、24 h)各3個(gè)亞組；干預(yù)組-2(12、24 h)各3個(gè)亞組。每個(gè)亞組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

各組NRK-52E細(xì)胞相同條件下培養(yǎng)至貼壁60%，細(xì)胞形態(tài)良好；按等量替代原則，在順鉑組(24 h)3個(gè)亞組分別加入用PBS稀釋后質(zhì)量濃度為50 mg/μL的順鉑溶液75、150、300 μL；同時(shí)，在干預(yù)組-1(24 h)3個(gè)亞組先后加入2.5 μL caspase-3抑制劑(10 mmol/L)與相應(yīng)質(zhì)量濃度的順鉑溶液；干預(yù)組-2(24 h)3個(gè)亞組先后加入5 μL caspase-3抑制劑(10 mmol/L)與相應(yīng)質(zhì)量濃度的順鉑溶液。12 h后用相同的方法在12 h各組中加相應(yīng)的順鉑及caspase-3抑制劑。所有試劑加入完畢后，各組最后共同培養(yǎng)12 h開始上機(jī)檢測。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測NRK-52E細(xì)胞的早凋亡率用Annexin V-FITC-碘化丙啶(propidium iodide,PI)法檢測各組NRK-52E細(xì)胞凋亡情況。每孔去上清后用0.5 mL不含EDTA的0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，顯微鏡下觀察消化過程，待貼壁細(xì)胞脫落后每孔用1 mL完培終止消化，將每孔細(xì)胞溶液(1 000 r/min離心5 min)收集于3 mL離心管，用PBS洗滌細(xì)胞2次(1 000 r/min離心5 min)收集2.5×105個(gè)細(xì)胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，先加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI，混勻；室溫、避光反應(yīng)15 min；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟至少重復(fù)3次，各組取3復(fù)孔，均獲得一致結(jié)果。各次實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果以表示，用SPSS 22.0進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析(One-way ANOVA，LSD法)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩空白對(duì)照組(12、24 h)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；24 h組普遍比12 h組晚凋亡率高(圖1～2)。未進(jìn)行任何干預(yù)的對(duì)照組早凋亡率最低，順鉑誘導(dǎo)后的NRK-52E細(xì)胞早凋亡率較對(duì)照組明顯升高，NRK-52E細(xì)胞早凋亡率與順鉑濃度呈正相關(guān)。Caspase-3抑制劑預(yù)處理組NRK-52E細(xì)胞凋亡程度較順鉑組輕(P＜0.01)；且20 μmol/L的caspase-3抑制劑比10 μmol/L的caspase-3抑制劑對(duì)減輕順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡作用更佳。24 h 10 μmol/L caspase-3干預(yù)組中，順鉑20 μmol/L和順鉑10 μmol/L組早凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且24 h 20 μmol/L caspase-3干預(yù)組中，順鉑20 μmol/L和順鉑10 μmol/L組早凋亡率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較 %

3 討論

順鉑的腎損傷機(jī)制牽涉多因素的共同作用：順鉑可通過對(duì)腎小管、腎血管的直接毒性作用，改變腎血流量和腎小球?yàn)V過率；順鉑可誘導(dǎo)腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)以及腎間質(zhì)纖維化；順鉑可通過各種細(xì)胞通路、細(xì)胞因子、信號(hào)分子的傳遞引起腎臟的炎癥、凋亡和壞死，從而直接損傷腎小管上皮細(xì)胞[2]。順鉑對(duì)腎臟的損傷具有劑量依賴性，如何最大程度地減少其腎毒性，達(dá)到順鉑對(duì)腫瘤患者最大治療效應(yīng)，成為目前治療難點(diǎn)。研究[3-5]表明，抗氧化劑及許多巰基配體如Dendropanax morbifera、SRT1720、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、4-亞甲藍(lán)基安息香酸、金屬硫蛋白等對(duì)順鉑所致腎毒性具有一定保護(hù)作用，但是否有其他藥物具有相似的作用，亦是目前研究熱點(diǎn)。

Caspase家族在經(jīng)典凋亡中具有重要作用，最后的凋亡過程通過caspase激活實(shí)現(xiàn)，caspase-3是最終的效應(yīng)因子，在細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中不可或缺，能裂解許多凋亡程序中級(jí)聯(lián)蛋白酶催化反應(yīng)中的蛋白，是凋亡途徑中的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者。近年來研究[6]發(fā)現(xiàn)，caspase-3除與心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性病變等發(fā)生有關(guān)外，通過抑制caspase-3的表達(dá)對(duì)缺血再灌注AKI亦有保護(hù)作用[7]，但其抑制劑直接作用順鉑所致AKI的研究目前國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)后的NRK-52E細(xì)胞早凋亡率較對(duì)照組明顯升高，NRK-52E細(xì)胞早凋亡率與順鉑濃度呈正相關(guān)，驗(yàn)證了順鉑腎毒性的劑量依賴性。Caspase-3抑制劑預(yù)處理組NRK-52E細(xì)胞凋亡程度較順鉑組輕，且20 μmol/L濃度的caspase-3抑制劑比10 μmol/L濃度的caspase-3抑制劑對(duì)減輕順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡作用更佳，說明caspase-3抑制劑通過抑制caspase-3干預(yù)細(xì)胞凋亡從而對(duì)順鉑所致AKI具有保護(hù)作用，且與濃度呈正比。24 h后比較10 μmol/L caspase-3干預(yù)組和20 μmol/L caspase-3干預(yù)組：順鉑20 μmol/L和順鉑10 μmol/L組差異性不大，上述情況考慮可能和順鉑及caspase-3共同干預(yù)時(shí)間有關(guān)，說明caspase-3抑制劑對(duì)減輕順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡作用具有時(shí)效性。

綜上所述，caspase-3抑制劑在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)順鉑所致AKI的保護(hù)作用，為臨床AKI的治療提供新的思路，但如何應(yīng)用于臨床，仍需進(jìn)一步研究。