陸 穎，陳 琪，張書強(qiáng)，胡 楠 ，徐 繪***

(1 南通大學(xué)教育部和江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院眼科；3南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海洋學(xué)院)

作為視覺系統(tǒng)的核心部位，視網(wǎng)膜負(fù)責(zé)接收光信號并將其轉(zhuǎn)化為電沖動傳遞給視神經(jīng)。視網(wǎng)膜屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，哺乳動物在因疾病或外傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷后，缺乏有效的再生能力[1-2]。與哺乳動物不同，脊椎動物模式生物斑馬魚具有強(qiáng)勁的視網(wǎng)膜再生能力[3]。斑馬魚的視網(wǎng)膜再生依賴于視網(wǎng)膜內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-Müller細(xì)胞(Müller glia,MG)[4]。視網(wǎng)膜損傷后，MG迅速去分化并增殖產(chǎn)生Müller細(xì)胞來源的祖細(xì)胞(Müller glia-derived progenitors,MGPCs)[5]，后者進(jìn)一步增殖并分化成各類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，最終修復(fù)視網(wǎng)膜并恢復(fù)大部分視力[6-8]。盡管對于斑馬魚的視網(wǎng)膜再生已有不少研究[9]，然而表觀遺傳學(xué)特別是組蛋白修飾在MG介導(dǎo)的視網(wǎng)膜再生中的作用仍不甚明了。本課題對組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs)在斑馬魚視網(wǎng)膜針刺損傷模型中的表達(dá)和功能進(jìn)行研究，揭示其在視網(wǎng)膜再生中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年野生型(AB)和轉(zhuǎn)基因型斑馬魚TG(1016tuba1a:GFP)[10]由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。斑馬魚相關(guān)實(shí)驗(yàn)的倫理審批由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20170320-017)。斑馬魚養(yǎng)殖條件為室溫28 ℃，14 h黑夜/10 h白天，無特殊病原體(specific pathogen free,SPF)系統(tǒng)水。實(shí)驗(yàn)用魚僅使用1次，且給予正常進(jìn)食及光照。

1.2 方法

1.2.1 視網(wǎng)膜RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR) 視網(wǎng)膜總RNA提取參照TRIzol試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)說明書進(jìn)行。RNA逆轉(zhuǎn)錄和qPCR參照課題組之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法[11]進(jìn)行。

1.2.2 視網(wǎng)膜針刺損傷和冰凍切片 斑馬魚視網(wǎng)膜針刺損傷的方法參照課題組之前的研究[12]。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)麻醉斑馬魚并收取眼球，取眼球前3 h腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)以標(biāo)記視網(wǎng)膜內(nèi)增殖的MG和MGPCs。取好的眼球于4% 多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)中室溫固定2 h，20%蔗糖處理6 h，并轉(zhuǎn)移至O.C.T中包埋、冰凍切片，切片厚度為12 μm。

1.2.3 曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)和丙戊酸(valproic acid,VPA)處理 TSA和VPA均購自美國Sigma公司，配置成1 mmol/L的貯存液保存。視網(wǎng)膜損傷后，利用1 mL注射器將稀釋成不同濃度的TSA(200 μmol/L)和VPA(5 μmol/L)行腹腔注射，1次/d，至實(shí)驗(yàn)取材。

1.2.4 免疫熒光染色 冰凍切片的免疫熒光染色方法參照Z.Q.ZHANG等[12]的研究方法。一抗：兔抗GFP(綠色熒光蛋白，1∶1 000，美國Thermo Fisher Scientific公司)，大鼠抗BrdU(1∶500，美國Abcam公司)，兔抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA，1∶500，美國GeneTex公司)。

1.2.5 BrdU標(biāo)記和MGPC譜系追蹤 BrdU標(biāo)記增殖MG和MGPCs及MGPCs的譜系追蹤方法參考Z.Q.ZHANG等[12]的研究。為標(biāo)記正在增殖的MG和MGPCs，斑馬魚在取材前3 h腹腔注射20 μL 20 mmol/L的BrdU溶液。譜系追蹤實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚在損傷后2 d(2 dpi)接受1次BrdU腹腔注射(20 μL,20 mmol/L BrdU)以標(biāo)記增殖的MGPCs，然后在第4天(4 dpi)取材。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0進(jìn)行分析，均值比較采用t檢驗(yàn)(雙尾)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜針刺損傷后HDACs的表達(dá)模式 為了解HDACs在斑馬魚視網(wǎng)膜針刺損傷后的表達(dá)模式，在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)(0 d未損傷對照、12 h、1 d、2 d、4 d和7 d)收取視網(wǎng)膜，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測HDAC家族基因的mRNA表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示，幾乎全部hdac的表達(dá)在損傷后12 h均顯著下調(diào)(圖1)。根據(jù)12 h后的表達(dá)模式，這些基因可分為3類：第一類在1～2 d時(shí)恢復(fù)至損傷前水平，之后再次下調(diào)或維持不變，包括hdac1、hdac6、hdac8、hdac10和hdac12(圖1)；第二類在1～2 d時(shí)表達(dá)顯著升高，包括hdac3、hdac4、hdac5和hdac7a(圖1)；第三類在1 d后仍維持下調(diào)，未能恢復(fù)至損傷前水平，包括hdac7b和hdac11(圖1)。HDACs在損傷后的動態(tài)變化提示它們可能在視網(wǎng)膜再生中發(fā)揮重要作用。

2.2 視網(wǎng)膜再生中MGPCs的形成需要HDACs已有研究[13-14]證實(shí)斑馬魚視網(wǎng)膜損傷后4 dpi內(nèi)核層(inner nuclear layers,INL)中BrdU+的細(xì)胞是多能性的MGPCs。為進(jìn)一步研究HDACs在視網(wǎng)膜再生中的功能，利用HDACs的抑制劑TSA和VPA來抑制HDACs的作用。斑馬魚在視網(wǎng)膜損傷后每日腹腔注射溶劑對照二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)或不同濃度的TSA(0.05、0.5和5 μmol/L)和VPA(2、20和200 μmol/L)，在4 dpi先腹腔注射BrdU標(biāo)記MGPCs，3 h后收取眼球并進(jìn)行冰凍切片。BrdU免疫熒光染色顯示TSA和VPA處理劑量依賴的減少了4 dpi INL BrdU+細(xì)胞的數(shù)量(圖2)，提示斑馬魚視網(wǎng)膜損傷后MGPCs的形成需要HDACs。

2.3 HDACs促進(jìn)斑馬魚視網(wǎng)膜MG的增殖 MGPCs的形成主要包括MG去分化(0～2 dpi)、不對稱分裂產(chǎn)生MGPC(2 dpi)和MGPC增殖(2～6 dpi)3個步驟[5,10]。為了解HDACs是否通過影響MG去分化和增殖調(diào)控MGPCs形成，本研究選用了轉(zhuǎn)基因斑馬魚系TG(1016tuba1a:GFP)，該魚系視網(wǎng)膜中去分化的MG會表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)[10]。轉(zhuǎn)基因斑馬魚在視網(wǎng)膜損傷后接受溶劑對照或TSA處理，然后在2 dpi檢測MG去分化和增殖情況。GFP/BrdU免疫熒光染色顯示TSA處理對損傷區(qū)域GFP+MG的數(shù)量和形態(tài)無顯著影響(圖3A～B)，但導(dǎo)致INL GFP+/BrdU+細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖3A、C)，提示HDACs不是MG的去分化過程所必需，但會促進(jìn)其不對稱分裂產(chǎn)生MGPCs。

2.4 MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程需要HDACs為了解HDACs是否影響MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程，本研究進(jìn)行了譜系追蹤實(shí)驗(yàn)。在2 dpi腹腔注射BrdU標(biāo)記增殖的MGPCs，然后在4 dpi通過冰凍切片進(jìn)行PCNA免疫熒光染色(圖4A)。在4 dpi視網(wǎng)膜內(nèi)PCNA+BrdU+細(xì)胞數(shù)量/BrdU+細(xì)胞數(shù)量的比值可以反映BrdU標(biāo)記的MGPCs后代在4 dpi時(shí)仍處于細(xì)胞周期中的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TSA處理顯著降低了該比值(圖4B～C)，提示MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程是需要HDACs的。進(jìn)一步通過qPCR分析了TSA對視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響，qPCR結(jié)果顯示TSA處理導(dǎo)致p21、p27和p57 3個周期素依賴激酶抑制物(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的表達(dá)顯著升高，而細(xì)胞周期素ccnd1的表達(dá)顯著下調(diào)(圖4D)，這與觀察到的增殖抑制表型相一致。TSA處理也導(dǎo)致2 dpi細(xì)胞周期素ccna2和ccne1的表達(dá)升高(圖4D)。這些結(jié)果顯示TSA處理干擾了細(xì)胞周期相關(guān)基因的正常表達(dá)，提示HDACs可能通過影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控MGPCs的細(xì)胞周期進(jìn)程。

3 討論

近年來，表觀遺傳學(xué)在神經(jīng)系統(tǒng)再生中的作用越來越得到重視。HDACs是一類蛋白酶，與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶一起在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮調(diào)控作用。HDACs的作用是將組蛋白末端的賴氨酸脫乙酰化，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊密從而抑制基因表達(dá)[15]。多項(xiàng)研究[16-17]報(bào)道在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，HDACs在神經(jīng)元軸突再生中起著重要作用。在視網(wǎng)膜再生中，通過在小鼠MG內(nèi)表達(dá)重編程因子Ascl1以及同時(shí)使用HDACs抑制劑，可以使小鼠MG轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜中間神經(jīng)元[18]。本研究檢測了斑馬魚視網(wǎng)膜損傷后多個hdac基因的表達(dá)，并通過抑制劑TSA和VPA研究了HDACs在視網(wǎng)膜再生中的作用。

QPCR結(jié)果顯示在視網(wǎng)膜針刺損傷后12 h幾乎所有的hdac均表現(xiàn)出不同程度的表達(dá)下調(diào)，推測在視網(wǎng)膜再生的早期階段，即MG的重編程過程，可能需要短暫的泛HDACs下調(diào)以利于再生基因的表達(dá)。在損傷后1～2 d，hdac3、hdac4、hdac5和hdac7a的表達(dá)出現(xiàn)了顯著的上調(diào)，這一時(shí)間段是MG完成去分化、開始不對稱分裂產(chǎn)生MGPCs的階段[10]，提示這4個HDACs可能在MG分裂和MGPCs增殖中發(fā)揮作用。一些HDACs在損傷早期下調(diào)而在后期上調(diào)，提示它們可能在視網(wǎng)膜再生中有雙重作用。但更細(xì)致的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步表達(dá)和功能研究，如針對具體的HDACs進(jìn)行原位雜交以確定其表達(dá)的位置和細(xì)胞類型，特異敲降不同的hdac基因以研究其功能等。

本研究發(fā)現(xiàn)HDACs主要參與調(diào)控MG和MGPCs的增殖。BrdU免疫熒光的結(jié)果顯示HDACs對MG的不對稱分裂有促進(jìn)作用。進(jìn)一步的譜系追蹤顯示缺失HDACs功能的MGPCs有更高的比例退出細(xì)胞周期，這提示HDACs是維持MGPCs細(xì)胞周期進(jìn)程的重要分子。MG和MGPCs的充分增殖是視網(wǎng)膜再生能否成功的必要條件，也是斑馬魚能獲得近乎完美的視網(wǎng)膜再生的關(guān)鍵因素之一[6]?，F(xiàn)有的利用MG重編程轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元的技術(shù)，均存在產(chǎn)生的神經(jīng)元數(shù)量有限，以及過多的轉(zhuǎn)分化導(dǎo)致MG丟失進(jìn)而可能影響視網(wǎng)膜正常生理功能等缺點(diǎn)[1,18]。因此，進(jìn)一步研究HDACs促進(jìn)MG和MGPCs增殖的機(jī)制，對于將來哺乳動物的視網(wǎng)膜再生可能有著重要的借鑒意義。HDACs有可能成為人類MG重編程和視網(wǎng)膜再生的治療靶點(diǎn)，為治愈退行性視網(wǎng)膜疾病提供一種全新的思路。