王 理 ，潘文潔，劉 瑩，顧娟娟，葉文欣，楊 婕，姚 敏***

(南通大學1 醫(yī)學院信息學系，2 智能信息技術研究中心，3 南通先進通信技術研究院，南通 226001；4 南通大學醫(yī)學院免疫學系；5 南通大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心；6 江蘇省海門市人民醫(yī)院腫瘤科；7 南通大學生命科學院)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已是最常見的慢性肝病之一[1-2]，成為除慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)或丙型肝癌病毒(hepatitis C virus,HCV)感染之外，與肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生密切相關的最主要的病原學因素[3-4]。NAFLD是一種臨床病理綜合征，肝組織伴有彌漫性脂肪變性和脂質(zhì)積聚，其機制復雜涉及胰島素抵抗、線粒體氧化功能異常、鐵超載、信號通路等，尚未完全清楚。近年，有關NAFLD的研究進展，非編碼RNA調(diào)控及線粒體內(nèi)膜肉毒堿棕櫚酰轉移酶-Ⅱ(carnitine palmitoyltransferase-Ⅱ,CPT-Ⅱ)失活等[5]被發(fā)現(xiàn)，然而脂肪變性肝細胞惡性轉化與肝癌發(fā)生關系仍倍受關注[6]。本文以脂肪積聚誘發(fā)肝細胞發(fā)生惡性轉化模型，以生物信息學技術分析基因表達譜、生物過程(biological process,BP)、信號通路等改變，觀察了甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)、CD44和Wnt3a等腫瘤相關標志的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 脂肪肝模型方法 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由南通大學實驗動物中心提供，5周齡、體質(zhì)量(110±10)g共60只，按研究設計隨機分為對照(normal control,NC)組(n=12)、NAFLD組(n=12)和脂肪肝誘癌組(n=36,6只/組×6)，于(22±2) ℃、12 h光/暗周期和濕度55%的環(huán)境中飼養(yǎng)。NC組以普通飼料喂養(yǎng)；NAFLD組以高脂飼料(10%蛋黃粉，10%豬油，4%膽固醇1%膽酸和普通飼料75%)喂養(yǎng)；脂肪肝誘癌組在NAFLD組的基礎上，繼續(xù)以高脂飼料加化學致癌物2-乙酰氨基芴(2-fluorenylacetamide,2-FAA)(0.05%,Sigma,USA)顆粒飼料喂養(yǎng)。每2周隨機取2只對照鼠、2只高脂鼠和一組脂肪肝誘癌鼠，乙醚麻醉，經(jīng)腹心臟采血5 mL，分離血清置-20 ℃保存；手術開腹腔摘取肝組織，部分于液氮速凍后放-80 ℃冰箱保存。實驗通過南通大學動物實驗倫理審查(2018-0228-001)。

1.2 肝病理組織學檢查 肝組織以病理學蘇木精-伊紅(Hematoxylin & Eosin,HE)染色法檢查：鼠肝組織經(jīng)10%(V/V)中性甲醇溶液固定后，以梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，于切片機上切片，溫水燙平貼到載玻片上，恒溫烘干。以二甲苯脫蠟，蘇木精溶液染色，水洗后在70%和90%乙醇中依次脫色，伊紅染色。經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明，滴樹膠，蓋玻片封固。在OLYMPUS BX51光鏡下觀察、攝片。

1.3 油紅O染色 每組切片行油紅O染色，按試劑使用說明書(南京建成公司)操作，在OLYMPUS IX71光鏡下進行觀察、攝片。通過Image Pro Plus 6.0軟件圖像分析系統(tǒng)，測定每個視野的紅色區(qū)域的面積與該視野總面積比，以代表每個肝組織脂肪的相對含量，進行圖像分析半定量研究。

1.4 基因芯片制備與RNA提取 肝組織100 mg加1 mL TRI reagent置冰上勻漿后，加200 μL氯仿混勻，以12 000 g，4 ℃離心15 min。吸上層透明水層，移到無菌離心管。加500 μL異丙醇混勻，以12 000 g，4 ℃離心10 min。除上清液加1 mL 80%乙醇混勻。以7 600 g，4 ℃離心5 min。移除乙醇，室溫5 min，以無RNase水30 μL溶解，RNA定量，以Affymetrix Phalanx表達譜芯片(v2版)，在安捷倫RNA 6000 nano assay檢測(上海儀方生物技術有限公司)，以基因表達信號比(signal logarithm ratio,SLR)表示各基因上調(diào)或下調(diào)。

1.5 RNA樣品放大與熒光標定反應 使用OneArray plus RNA amplification kit(華聯(lián)公司)。以T7 Oligo引子產(chǎn)生cDNA，加RNase及DNA聚合酶合成第二股cDNA；以T7啟動子行反義RNA合成，加aa-UTP形成aa-aRNA，再加NHS-CyeDye。NHS與Amino Allyl反應，使aa-aRNA變成CyeDye-aRNA完成標定；純化后與Phalanx OneArray TM雜交，經(jīng)清洗及訊號偵測后分析。在Agilent Microarray Scanner(G2505C)掃描，PMT100%與10%于10 μm分辨率行2次掃描。再用GenePixTM4行影像數(shù)據(jù)擷取，獲2份初級數(shù)據(jù)格式gpr檔案，最后用華聯(lián)芯片內(nèi)之控制探針行2份gpr數(shù)據(jù)訊號強度轉換，并整合成1份gpr數(shù)據(jù)文件進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.6 生物信息學分析 用Rosetta Resolver R System(Rosetta Biosoftware)進行數(shù)據(jù)前處理(含數(shù)據(jù)篩選、校正)與統(tǒng)計計算，按差異表達基因篩選閾值為|log2倍數(shù)|≥1且P＜0.05來篩選差異基因，在R3.0.3版本環(huán)境下以amap、ctc和gplots等package進行聚類分析，最后將篩選出來的差異基因進行基本信息注釋Gene Ontology分析、Pathway分析并對資料進行歸納、整理和分析。

1.7 差異表達基因互作網(wǎng)絡分析 將篩選的差異表達基因上傳DAVID生物信息學數(shù)據(jù)庫行基因本體論(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，找差異表達基因分子功能、細胞組成、生物過程和富集KEGG信號通路。

2 結果

2.1 脂肪肝模型組織病理學及肝脂肪染色 60份肝組織按病理組織學檢查(HE染色)分為5組：NC組(n＝12,圖1A)，鏡下肝細胞以肝小葉中央靜脈為中心呈索狀排列的，細胞邊界清楚，胞核大而圓，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏，染色較淺，肝小葉及匯管區(qū)無炎性細胞浸潤(圖1A1)，未見脂肪積聚(圖1A2)；NAFLD組(n＝12,圖1B)，鏡下肝細胞索排列不清，細胞體積增大、腫脹，核深染，胞漿中出現(xiàn)大小不等脂肪空泡(圖1B1)，將胞核擠向一側，肝小葉及匯管區(qū)見少量炎性細胞浸潤，細胞中脂肪堆積明顯(圖1B2)；肝細胞變性(hepatocyte degeneration,H-deg)組(n＝14)，鏡下肝細胞索排列紊亂、邊界不清，肝小葉及匯管區(qū)炎性細胞浸潤明顯，核清晰，少量異型性，核周圍許多小空炮并融合為大空泡，輕度肝纖維化，脂肪染色明顯；癌前(precanceraion,Pre-c)組(n＝12)，鏡下見肝假小葉形成，炎性細胞浸潤，核深染、多核，不典型增生，纖維化明顯和脂肪著色；癌變(liver cancer,LC)組(n＝10)，鏡下肝組織中腫瘤細胞呈巢狀排列，大小不一，邊界模糊，核圓深染且多核和明顯脂肪著色。肝細胞惡性轉化不同階段的脂肪經(jīng)油紅O染色，通過Image-Pro-Plus軟件定量分析，結果顯示與NC組鼠肝比較，NAFLD組脂肪含量升高9倍(t＝14.781,P＜0.001)、H-deg組2.4倍(t＝5.962,P＜0.001)、Pre-c組2.3倍(t＝8.375,P＜0.001)和LC組8倍(t＝11.976,P＜0.001)，肝細胞脂肪積聚明顯。

2.2 肝脂肪積聚與相關基因表達譜分析 脂肪肝惡性轉化過程中血脂與肝酶學異常。NAFLD組、Hdeg組、Pre-c組和LC組血清總膽固醇(2～3倍)，三酰甘油濃度(1.5～4.5倍)明顯高于NC組，誘癌后Hdeg、Pre-c和LC過程中伴肝細胞損傷，丙氨酸轉移酶及門冬氨酸轉移酶活性為NC組的4～8倍。由NC、NAFLD、脂肪肝誘癌后出現(xiàn)H-deg、Pre-c和LC鼠肝組織的全基因表達譜散點圖(圖2)可見，LC組與NC組差異基因的對比變化最明顯，顯示在脂肪肝進展的不同階段，均有多基因參與肝細胞的惡性轉化。

2.3 差異基因的聚類分析 基因表達譜分析顯示，與NC組肝組織(log2比率≥1.0和P＜0.05；2倍為-1.0≤log2比率≥1.0)比較，NAFLD組、H-deg組、Pre-c組和LC組肝組織中上調(diào)基因分別有70、609、1 015和1 234個，下調(diào)基因分別為93、325、437和504個，總共有4 287個差異表達基因。其中，差異表達基因在LC組vs NC組變化最為顯著，共篩選出1 738個。NAFLD組vs NC組差異表達基因上調(diào)和下調(diào)前30個差異基因表達聚類分析見表1。

2.4 GO功能富集分析 差異基因分別進行GO分析，包含BP，細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)信息。BP主要富集于膽固醇、脂質(zhì)的合成及代謝、氧化還原等；與NC組比較，H-deg組富集在有絲分裂M期、細胞周期、細胞分裂、固醇合成等過程；Pre-c組富集在固醇合成、有絲分裂M期、細胞周期、細胞分裂等過程；LC組富集在內(nèi)源性刺激、甾體激素、激素刺激的反應，固醇、羧酸及有機酸等生物合成過程。CC主要富集于細胞的組分、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等；H-deg組富集在染色體著絲粒區(qū)、微管細胞骨架、紡錘體及細胞外等組分；Pre-c組集中在微管細胞骨架、染色體著絲粒區(qū)、質(zhì)膜、細胞外及紡錘體等組分；LC組富集于細胞外部分、微管細胞骨架、質(zhì)膜、細胞外基質(zhì)等組分。MF主要富集于氧化還原酶及酸巰基酶活性，肽抗原、鐵離子、輔因子結合等功能；與NC組比較，Hdeg組富集在蛋白二聚體、蛋白同源二聚體及氧化還原酶活性，同種蛋白、鐵離子、維生素結合等功能；Pre-c組集中在生長因子、鈣依賴性磷脂、同種蛋白及胰島素樣生長因子結合，氧化還原酶及酸巰基酶活性；LC組富集于有機酸鈉轉運體、微管運動、蛋白二聚活性，同種蛋白、鈣離子、細胞骨架蛋白結合等功能。

表1 NAFLD組vs NC組差異表達基因中上調(diào)和下調(diào)的前30個差異基因表達聚類分析

2.5 KEGG通路分析 應用KEGG數(shù)據(jù)庫對各組差異表達基因進行分析，對它們在生物體內(nèi)各信號轉導通路中的富集度進行查找分析顯示：與NC組相比，NAFLD組差異基因主要富集于脂質(zhì)合成相關通路(類固醇生物合成、萜類骨架生物合成及非飽和脂肪酸生物合成)以及免疫系統(tǒng)相關通路(產(chǎn)生IgA腸免疫網(wǎng)絡、抗原提呈、移植物抗宿主病等)，見表2；H-deg組主要富集于脂質(zhì)合成相關(類固醇生物合成、非飽和脂肪酸生物合成、PPAR通路)、氨基酸代謝相關(谷胱甘肽代謝、甘氨酸,絲氨酸和蘇氨酸代謝)及細胞周期及腫瘤相關(P53通路、細胞周期)通路；Pre-c組富集于脂質(zhì)合成的類固醇生物合成、過氧化物酶體增殖物激活受體通路、花生四烯酸代謝、谷胱甘肽和氮代謝及細胞周期及腫瘤相關(P53通路、細胞周期、小細胞肺癌及黑素瘤)通路；LC組富集于脂質(zhì)合成[類固醇生物合成過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)通路]相關、細胞黏附、氨基酸代謝及細胞周期及腫瘤相關P53通路。可見脂肪肝惡化轉化中差異基因眾多，信號通路主要有固醇合成、P53、細胞周期信號通路，其中固醇合成通路Cyp51，Tm7sf2顯著下調(diào)，Ccnb1和周期蛋白依賴性激酶1 (cyclin-depen dent kinases 1,CDK1)與P53通路和細胞周期相關，在蛋白相互作用中處關鍵位置。

2.6 脂肪肝惡性轉化相關標志物 在脂肪積聚狀態(tài)下，觀察肝細胞發(fā)生惡性轉化過程中部分常用肝癌標志物在基因轉錄水平上動態(tài)變化(圖3)，結果顯示：與NC組比較，GPC-3基因在H-deg組(t=3.151,P=0.010)、Pre-c組(t=5.098,P<0.001)和LC組(t=2.66,P=0.024)中明顯上調(diào)(圖3A)；AFP基因表達，在Pre-c組(t=4.051,P=0.003)和LC組(t=2.836,P=0.021)中顯著上調(diào)(圖3B)；CD44基因表達，在H-deg組(t=-5.364,P<0.001)、Pre-c組(t=4.399,P=0.002)和LC組(t=2.706,P=0.039)中明顯升高(圖3C)；Wnt3a基因表達，在Hdeg組(t=7.221,P<0.001)、Pre-c組(t=6.472,P<0.001)和LC組(t=6.809,P<0.001)顯著上調(diào)(圖3D)。顯示在肝脂肪積聚狀態(tài)下，相關癌胚型標志物隨脂肪肝惡性轉化嚴重程度增加而呈顯著上調(diào)表達。

表2 NAFLD組vs NC組差異基因富集分析的主要KEGG通路

3 討論

HCC危險因素包括NAFLD，它是肝細胞過量脂質(zhì)蓄積，有關學說或機制眾多，如胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化、細胞因子過表達、脂質(zhì)代謝紊亂和鐵超載等，除此遺傳、環(huán)境、免疫和藥物等對NAFLD均有影響，可促使NAFLD發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至HCC[2,6]。本研究通過基因表達譜芯片和生物信息學技術，分析脂質(zhì)積累誘導肝細胞惡性轉化過程中起關鍵作用的基因及相關分子的所在信號通路，為探討肝細胞發(fā)生脂質(zhì)積累狀態(tài)下發(fā)生惡性轉化分析機制，為肝癌早期診斷、個性化治療和預后預測奠定基礎。

脂肪積聚肝惡性轉化分子機制尚不清楚。以高脂飲食和2-FAA建立脂肪肝惡性轉化的動態(tài)模型，從基因表達譜獲得差異表達基因甚多，NAFLD組數(shù)百個，H-deg、Pre-c和LC階段差異數(shù)以千計；上調(diào)基因中獲多個與線粒體及氧化呼吸鏈相關的基因?；钚匝踹^量致氧化應激反應，造成細胞損傷，病理機制如磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)下游絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt/蛋白激酶B磷酸化，在細胞凋亡、細胞周期控制、葡萄糖代謝和氧化應激抗性等方面有重要作用，且與PI3K-Akt通路聯(lián)系緊密。線粒體內(nèi)膜CPT-Ⅱ通過阻斷體內(nèi)脂肪酸的β 氧化，CPT-Ⅱ含量減少造成惡性循環(huán)[7]，肝脂質(zhì)積累加重損傷肝細胞。篩選出關鍵基因和富集信號均與細胞氧化應激相關，氧化損傷細胞及DNA增多超過細胞修復后發(fā)生基因突變，進而致其惡性轉化，參與癌變發(fā)生過程。

肝細胞惡性轉化相關通路主要有Wnt、血管內(nèi)皮生長因子、絲裂原活化蛋白激酶、Janus蛋白酪氨酸激酶、PI3K/絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt等，通過表達譜芯片數(shù)據(jù)篩選出脂肪積聚狀態(tài)下與肝細胞惡性轉化相關通路，包括類固醇生物合成和細胞周期及P53通路，新發(fā)現(xiàn)Cyp51和Tm7sf2、Ccnb1和CDK1在相互作用網(wǎng)絡中均處關鍵位置與惡性轉化相關：如Cyp51編碼細胞色素P450與HCV所致肝癌有關[8]，其與NAFLD相關肝癌尚未發(fā)現(xiàn)；Tm7sf2基因缺乏導致核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)上調(diào)。由Tm7sf2編碼蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，缺乏損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能；Tm7sf2缺失致三酰甘油積聚持續(xù)脂肪變性[9]，G1/S期延遲，降低細胞分裂，致P53改變誘導p21表達Ccnb1與腫瘤相關[10]；CDK1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，細胞有絲分裂及增殖關鍵蛋白，為抗腫瘤藥物靶點[11]。

惡性轉化相關部分差異表達基因如模型篩選出標志GPC-3、AFP、CD44和Wnt3a異常上調(diào)[12]；癌胚型GPC-3位于Wnt/β-catenin通路上游，可激活Wnt3a等下游信號分子，促進細胞發(fā)生惡性轉化生長或腫瘤細胞生長；CD44屬于干性信號分子，它的激活可促進肝細胞轉化，且可介導細胞與基質(zhì)、細胞與細胞間黏附促進腫瘤轉移；提示脂肪肝惡性轉化中，肝癌相關分子標志無論在mRNA還是蛋白水平均顯著升高，可在肝細胞癌前病變階段早期監(jiān)測或診斷肝癌。

總之，本文制備NAFLD模型并和誘導肝細胞惡性轉化，觀察基因表達譜動態(tài)變化。從NAFLD到Hdeg、Pre-c和LC的發(fā)展過程中，差異基因眾多，生物學過程集中在肝細胞對刺激反應的代謝調(diào)節(jié)，類固醇合成、P53、細胞周期等信號通路與脂肪肝惡性轉化密切相關，新發(fā)現(xiàn)Cyp51、Tm7sf2、Ccnb1和CDK1為關鍵基因，癌胚型標志可早期監(jiān)測脂肪肝的惡性轉化，為尋找理想標志及NAFLD防治，提供了有用生物學信息。