王麗麗苗則彥王 鑫吳海東劉愛(ài)群

(1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161； 2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，遼寧 沈陽(yáng)110161)

20世紀(jì)80年代，遼寧省義縣開(kāi)始發(fā)展設(shè)施西葫蘆(CucurbitapepoL.ssp.pepo)生產(chǎn)。至今，日光溫室西葫蘆生產(chǎn)面積達(dá)3 300 hm2，占當(dāng)?shù)卦O(shè)施蔬菜總面積的41.25%，成為遼寧省反季節(jié)西葫蘆栽培主產(chǎn)區(qū)[1]。當(dāng)?shù)匚骱J主栽品種為凱撒，主要以自根苗栽培為主，嫁接栽培技術(shù)應(yīng)用較少。近年來(lái)，由于連續(xù)多年的單一茬口重茬種植，當(dāng)?shù)厣a(chǎn)中“死秧”現(xiàn)象普遍發(fā)生，嚴(yán)重地塊發(fā)病率達(dá)75%以上，成為制約義縣西葫蘆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。遼寧省有關(guān)專家到發(fā)病區(qū)鑒定，初步認(rèn)為是尖孢鐮刀菌引起的枯萎病或者是茄病鐮刀菌引起的根腐病，但不能確定是哪類菌源。有研究報(bào)道遼寧地區(qū)引起嫁接黃瓜“死秧”問(wèn)題的病原菌為茄病鐮刀菌瓜類?；?Fusariumsolanif.sp.Cucurbitae)，并對(duì)該菌致病特征、侵染途徑等做了詳細(xì)報(bào)道[2]。該病菌引起的發(fā)病癥狀為在莖基部與土壤相接處呈現(xiàn)水浸狀褐色病斑，局部萎蔫，嚴(yán)重發(fā)病植株并未枯萎而直接倒伏，扒開(kāi)基質(zhì)可見(jiàn)根莖部發(fā)病較嚴(yán)重，根部受害并不重，發(fā)病癥狀與義縣西葫蘆類似。該病害初步定名為根莖腐病[3]。

有關(guān)茄病鐮刀菌瓜類專化型病原菌在國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。1932年最早在南非報(bào)道引起南瓜根莖腐病，隨后在荷蘭嫁接黃瓜爆發(fā)[4]。最初發(fā)現(xiàn)該病原菌也只在田間侵染南瓜，未在甜瓜、西瓜等瓜類作物發(fā)生。隨著病原菌的發(fā)展，隨后在歐美國(guó)家陸續(xù)報(bào)道，甚至在西班牙的西瓜、西葫蘆、甜瓜作物均被侵染致病[5～7]。隨著病原菌鑒定技術(shù)不斷更新，鑒定手段從形態(tài)學(xué)鑒定到分子生物學(xué)鑒定，研究者進(jìn)一步將該專化型真菌劃分為2個(gè)生理小種[8]，并做了大量分子生物學(xué)研究[9～10]。目前，真菌測(cè)序分析常見(jiàn)方法為ITS序列分析方法，該方法不能準(zhǔn)確判斷出病原菌的種級(jí)分類水平。為了更準(zhǔn)確鑒定遼寧義縣地區(qū)的致病菌是否為茄病鐮刀菌瓜類?；?，本研究采用rDNAITS、EF序列分析方法，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并設(shè)計(jì)?；万?yàn)證試驗(yàn)，旨在為生產(chǎn)提供有力理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年，以遼寧省義縣前窖、龍王廟、頭溝3個(gè)地方5個(gè)試點(diǎn)感病西葫蘆的植株為試材，進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 病原菌的分離鑒定

采用傳統(tǒng)的組織分離法對(duì)病樣進(jìn)行病原物的分離純化。PDA培養(yǎng)基配置： 200 g馬鈴薯切片加適量水煮30 min后過(guò)濾，取濾液加15 g葡萄糖，15 g瓊脂，定容至1 L，121 ℃濕熱滅菌20 min待用。培養(yǎng)前在PDA培養(yǎng)基內(nèi)加少量青霉素、鏈霉素，在直徑90 cm培養(yǎng)皿無(wú)菌條件培養(yǎng)。將分離得到的菌株在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，挑取尖端菌絲，培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子，進(jìn)行單孢純化，并將純化后的菌株保存在PDA培養(yǎng)基上，4 ℃保存。

1.3 Koch's 法則鑒定致病性

根據(jù)Koch's 法則，將分離獲得的單孢菌株回接鑒定致病性。以西葫蘆“萊特”品種為試材，采用32孔穴盤，每個(gè)單孢菌株接菌一盤，3次重復(fù)。播種前催芽，待種子剛露白時(shí)播種到菌土中。接菌方法參照劉洋(2010)方法。調(diào)查植株發(fā)病情況，選取出現(xiàn)類似癥狀的植株根莖部進(jìn)行病原菌的再次分離鑒定確定所得單孢菌株是否為田間致病菌。

1.4 ?；丸b定試驗(yàn)

選擇11種蔬菜作物進(jìn)行接種鑒定，品種見(jiàn)表1。

表1 蔬菜作物品種及來(lái)源

1.5 病原菌測(cè)序方法

真菌DNA采用試劑盒[OMEGE Fungal DNA Kit(50)試劑盒 (美國(guó))]方法提取。真菌ITS序列及EF-1α序列分析比較，序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：DNA 模板2 μl、10×Buffer(含Mg2+)2 μl、Taq polymerase(5 U/μl)0.4 μl，引物(10 μmol /μl)各1 μl，dNTP(10 mmol/ L)4μl，ddH2O 10 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI核算序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性搜索比對(duì)，獲得基因登錄號(hào)。

表2 ITS和EF引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌形態(tài)學(xué)觀察表明，菌落薄絨狀，氣生菌絲較少，白色至淺灰色；菌落背面中心呈褐色。小型分生孢子數(shù)量多，有大型分生孢子(圖1)。

2.1.2 Koch's 法致病性鑒定

對(duì)獲得的109個(gè)單孢菌群進(jìn)行回接鑒定致病性結(jié)果表明，不同來(lái)源菌株均可使西葫蘆發(fā)病，發(fā)病率最高達(dá)100%，且發(fā)病植株癥狀與遼寧義縣地區(qū)田間植株發(fā)病癥狀一致，確定分離獲得的109個(gè)菌株均為田間致病病原菌。

2.1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用ITS、EF序列對(duì)109個(gè)單孢菌株進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，ITS序列分析結(jié)果為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)，登錄號(hào)為MN523142.1，相似度達(dá)99.61%。同時(shí)，Nectriahaematococca為鐮刀菌瓜類專化型的有性態(tài)，登錄號(hào)為AF178410.1，相似度達(dá)99.40%，在NCBI同源性比對(duì)結(jié)果中將其無(wú)性態(tài)描述為茄病鐮刀菌瓜類?；?Fusariumsolanif.sp.cucurbitae)。EF序列測(cè)序結(jié)果與ITS結(jié)果一致，且能準(zhǔn)確鑒定為茄病鐮刀菌瓜類轉(zhuǎn)化型，登錄號(hào)為KF372878.1，相似度為100%(表4)。

2.2 ?；丸b定試驗(yàn)

選擇登陸號(hào)為KF372878.1(茄鐮刀菌瓜類專化型)的菌種，對(duì)11種蔬菜作物進(jìn)行接種鑒定。結(jié)果表明，西葫蘆、黃瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜、南瓜、西瓜均不同程度發(fā)病，其中西葫蘆、甜瓜、南瓜發(fā)病最重，達(dá)100%。甜瓜發(fā)病最早，而番茄、辣椒、菜豆、茄子均未發(fā)病(表5)，說(shuō)明該菌為瓜類作物專化型真菌。

表3 不同來(lái)源菌株的致病性鑒定結(jié)果

表4 病原菌測(cè)定基因序列匹配信息

表5 致病性調(diào)查結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明，引起遼寧義縣西葫蘆“死秧”的病原菌主要為茄病鐮刀菌瓜類?；筒≡?。比較ITS、EF序列分析結(jié)果，EF序列測(cè)序可獲得與NCBI中已有序列同源性更高的菌種信息，相似度達(dá)100%。?；万?yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，只有瓜類蔬菜作物西葫蘆、黃瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜、南瓜不同程度發(fā)病，非瓜類作物番茄、辣椒、菜豆、茄子均未發(fā)病，進(jìn)一步證明了鑒定結(jié)果的一致性。

國(guó)外早期報(bào)道，茄病鐮刀菌瓜類專化型包括2個(gè)生理小種。生理小種1可以侵染植株的莖基、根及果實(shí)，引起莖基、根及果實(shí)腐爛；而生理小種2只侵染果實(shí)引起果實(shí)腐爛。由生理小種1引起的根莖腐病最早在荷蘭小胡瓜有報(bào)道[11]，隨后在西班牙葫蘆[12]、西瓜、溫室西葫蘆、甜瓜作物相繼報(bào)道。本試驗(yàn)中日光溫室西葫蘆發(fā)病特征主要是在莖基部，所以，應(yīng)該屬于生理小種1引起的。目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。

真菌分子生物學(xué)鑒定方法一般采用rDNA-ITS基因序列分析。本試驗(yàn)采用rDNA-ITS、EF兩種基因的序列分析，鑒定結(jié)果均為茄病鐮刀菌瓜類?；筒≡?，結(jié)果一致。其中，利用ITS序列分析，在NCBI基因庫(kù)比對(duì)結(jié)果為茄病鐮刀菌的有性態(tài)，其無(wú)性態(tài)描述為茄病鐮刀菌瓜類專化型。而EF基因序列分析鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度更高，獲得的真菌信息更全面，且相似度達(dá)到100%。不同的序列分析方法對(duì)不同菌種有著不同的適應(yīng)性。對(duì)于建立病原菌種屬關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，單純采用ITS序列分析方法不能準(zhǔn)確判斷出病原菌的種級(jí)分類水平，而EF序列分析鑒定結(jié)果可以獲得同源性較高的菌種信息[13]。所以，本試驗(yàn)采用ITS、EF兩種序列分析，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

對(duì)11個(gè)蔬菜作物接種鑒定表明，該菌具有?；浴＿@與前人實(shí)驗(yàn)室接種鑒定致病性的結(jié)果一致[2]。人們對(duì)茄病鐮刀菌瓜類?；筒≡奶匦?、致病特征、侵染途徑及侵染作物等做了詳細(xì)報(bào)道，但至今也未篩選出抗病砧木，藥劑篩選也未見(jiàn)報(bào)道，生產(chǎn)中亟需建立一套高效病害防控技術(shù)體系，解決由該病原菌引起的土傳病害。