王 琛高 雅張曉黎韓艷秋吳興壯

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161)

藍(lán)莓又名越橘、藍(lán)漿果，杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp)，多年生落葉或常綠灌木[1]。果實為藍(lán)色或深紫色圓形漿果，其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)保健功能，深受人們的喜愛，堪稱“世界水果之王”，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為“人類五大健康食品”之一[2]。近幾年，我國藍(lán)莓的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐漸升高，并以良好的態(tài)勢持續(xù)增長[3]。但是，藍(lán)莓皮薄多汁且質(zhì)地柔軟，采后貯藏期間極易腐爛變質(zhì)，其貯藏品質(zhì)和貯藏期限均受到嚴(yán)重挑[4]。

硬度是藍(lán)莓果實的重要品質(zhì)，決定其消費(fèi)性、耐貯性和抗病性[5]。硬度下降軟化是果實腐爛的前提，它除了與自身的衰老機(jī)制有關(guān)，還與致腐霉菌的侵染存在一定關(guān)系[6]。同時，某些霉菌能夠產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重危害人類健康[7]。有些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)附著在果實表面的致腐霉菌通過識別寄主，產(chǎn)生大量的胞外果膠酶和纖維素酶，分解果實細(xì)胞壁多糖，使果實組織結(jié)構(gòu)變軟，釋放水分和其他成分，再把這些物質(zhì)當(dāng)作養(yǎng)分繁殖生長[8]。目前，研究發(fā)現(xiàn)侵染藍(lán)莓果實的病原真菌有很多種類，但它們之間存在著地域的差異性，且不同霉菌侵染后的癥狀和對果實品質(zhì)的影響也截然不同[9]。因此，本試驗從軟化的貯藏藍(lán)莓果實表面分離純化果實致腐霉菌菌株，通過形態(tài)學(xué)鑒定確定各霉菌的種類，并進(jìn)一步通過人工接種方式研究各霉菌侵染后對冷藏藍(lán)莓果實軟化的影響，以期為藍(lán)莓果實采后保鮮提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍(lán)莓品種為“藍(lán)豐”，于2018年6月20日采摘于沈陽時圣藍(lán)莓基地，果實成熟飽滿，大小色澤一致(直徑1.2～1.5 cm)，且無病蟲害與機(jī)械損傷。采后藍(lán)莓分裝于帶氣孔的PET保鮮盒中(凈重：125.0 g/盒)，并于當(dāng)日運(yùn)回實驗室冷藏備用，冷藏溫度為 5±0.5 ℃，相對濕度85%～95%。

1.2 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、查氏瓊脂培養(yǎng)基(CA)、查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)和 25 %甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(G25N)。各培養(yǎng)基的配方及制作方法參照《中國真菌志》[10]。

1.3 霉菌的分離純化

冷藏35 d后，隨機(jī)挑選軟化的藍(lán)莓鮮果20粒，加入到 250 ml 的無菌水中制備菌懸液，并依次梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。分別取1 ml 稀釋液與50 ℃液體PDA 培養(yǎng)基混合搖勻，待凝固后在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。挑取外觀為絲狀的單菌落，采用劃線法在無菌 PDA 平板上分離得到純菌種。再采用三點(diǎn)法將分離得到的純菌接種到CA平板上進(jìn)一步純化。重復(fù)接種3代，將純化后的菌種于4 ℃保存。

1.4 霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

采用三點(diǎn)法將分離到的霉菌分別接種到PDA、CA、CYA、G25N平板上，25～28 ℃培養(yǎng)7 d。分別記錄菌落大小、顏色、質(zhì)地及生長速度等特征，并在40倍顯微鏡下觀察它的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、主要形態(tài)、分生孢子的位置、形狀等特征，依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行心態(tài)學(xué)鑒定[11]。

1.5 霉菌的人工接種

采用穿刺接種方法[12]，隨機(jī)挑選藍(lán)莓鮮果，清洗后用200 mg/L次氯酸鈉浸泡10 min消毒，再用70%酒精噴涂蘋果表皮。在果實表面中心位置上刺入 1 mm(直徑)×3 mm(深)的傷口，注入霉菌孢子懸浮液 10 μl(1×105CFU/ml)。以未接種為對照，不同霉菌平行接種藍(lán)莓15盒，然后于5±0.5 ℃冷庫中冷藏，相對濕度為85 % ～95 %。貯藏35 d后取樣，每組樣品隨機(jī)抽取3盒藍(lán)莓，觀察果實軟化程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌屬的鑒定結(jié)果

從軟化的藍(lán)莓果實表面上分離純化出17株霉菌，編號為J-1 ～ J-17。觀察各霉菌在PDA培養(yǎng)基的菌落形態(tài)和水浸片3的鏡檢結(jié)果，結(jié)合《中國真菌志》[10]和《真菌鑒定手冊》[11]，分為 4個屬：其中鐮孢屬2株，分別為J-1和J-17；毛霉屬3株，分別為J-2、J-10和J-17；青霉屬6株，分別為J-3、J-8、J-11、J-5、J-9和J-13；曲霉屬6株，分別為J-4、J-15、J-16、J-6、J-7和J-12。具體描述見表1。

2.2 J-1和J-17霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)

J-1和J-17霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)如圖1所示，菌落在PDA培養(yǎng)基上的菌落較大，白色或淡紫色氣生菌絲呈羊毛狀，常表現(xiàn)為粉末狀，中心有小凸起，菌落背面呈紫紅色；在CA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)35～40 mm，乳白色絮狀，中心凸起顏色偏暗，菌落背面呈淡黃色；在CYA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)40～45 mm，白色絨毛絮狀，中心有臍狀凸起，菌落背面呈淡黃色，中心顏色加深。大型分生孢子形似鐮刀，又直又細(xì)，有較薄的細(xì)胞壁，小型分生孢子有短棒形和梨形，無分隔，產(chǎn)于復(fù)瓶?；騿纹抗＃湢钪?，或假頭狀著生。由此可鑒定J-1和J-17霉菌為層出鐮孢菌(Fusariumprolifertum)。

2.3 J-2、J-10、J-14霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)

J-2、J-10、J-14霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)如圖2所示，其菌落在PDA培養(yǎng)基上的菌落為黃褐色至暗黃綠色，邊緣為灰白色，呈絨毛狀，表面干燥，中心有凸起，菌落反面無色；在CA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)25～30 mm，菌落為灰白色，菌絲呈絨毛狀，菌落背面為淡黃色，中心凸起為橘黃色；在CYA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)30～35 mm，菌落顏色為黑灰色，表面有灰白的菌絲體，菌絲密集呈棉絮狀，邊緣為絲絨狀，菌落背面為灰黃色，有少量褶皺。菌絲無隔、多核，呈分枝狀，菌絲體較寬，可廣泛蔓延且無假根，各分枝頂端著生球形孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)大量的球形孢子的厚垣孢子。由此可鑒定J-2、J-10、J-14霉菌為總狀毛霉菌(Mucorracemosus)。

2.4 J-3、J-8、J-11霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

J-3、J-8、J-11霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)如圖3所示，其菌落在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，顏色為暗綠色，表面平坦，有滲出液，質(zhì)地為密氈狀，白色邊緣呈絨狀，菌絲體為灰白色，背面淡黃或接近無色；在CYA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)30～35 mm，呈暗藍(lán)綠色，表面平坦且有大量黃色滲出液，邊緣灰白色，背面有放射狀褶皺，呈棕黃色；在G25N培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)10～15 mm，呈絲絨狀，無滲出液，中心后邊緣薄，有較多的分生孢子，由黃褐色逐漸變?yōu)樗{(lán)綠色，背面呈棕黃色，有放射性褶皺。

表1 菌落及分生孢子結(jié)構(gòu)特征

分生孢子梗在營養(yǎng)菌絲處分枝，由副枝到梗基進(jìn)行分叉，梗基一般分為3個，呈放射狀生長著小梗，上面著生著鏈狀的分生孢子，分生孢子呈近球形。由此可鑒定J-3、J-8、J-11霉菌為圓弧青霉(Penicillumcyclopium)。

2.5 J-5、J-9、J-13霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

J-5、J-9、J-13霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)如圖4所示，其菌落在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈斑點(diǎn)狀，顏色為草綠色，質(zhì)地密氈狀，有的有同心環(huán)，菌絲體為灰白色，中心絨毛狀凸起，背面淡黃色，有放射性褶皺；在CYA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)35～40 mm，呈暗藍(lán)綠色，質(zhì)地絲絨狀，有少量滲出液，中心面凹凸不平，有黃綠色絮狀物，菌落邊緣面上有明顯的顆?；蚍勰?，菌落背面呈黃褐色，中心凸起部深褐色，有少量褶皺，菌絲體呈白色；在G25N培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)12～22 mm，呈黃綠色或藍(lán)綠色，中心較厚且凹凸不平，有較多的不規(guī)則褶皺，質(zhì)地絲絨狀，表面平坦或有顆粒，菌落背面呈淡黃色。分生孢子梗端1～2次帚狀分枝，瓶狀小梗細(xì)長，分生孢子呈圓形或扁圓形，聚集時呈青綠色。由此可鑒定J-5、J-9、J-13霉菌為擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)。

2.6 J-4、J-15、J-16霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)

J-4、J-15、J-16霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)如圖5所示，其菌落在PDA培養(yǎng)基上的菌落快速生長且無定型，為暗黃綠色，呈絨毛狀或粉末狀，質(zhì)地疏松，表面干燥，有不明顯的同心環(huán)，中心凸起，菌落背面無色；在CA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)10～15 mm，菌落中心為黃綠色，邊緣為淡黃色，菌絲呈絨毛狀，平坦略有放射狀皺紋，菌落反面無色；在CYA培養(yǎng)基上菌落快速生長，無定型，呈暗綠色，質(zhì)地由疏松變?yōu)橹旅?，菌落表面平坦，有放射狀皺紋，中心凸出有絮狀菌絲體，呈黃綠色，菌落背面呈淡黃色。菌絲體有隔，分生孢子梗較長，上面有許多分生孢子，呈鏈球狀，表面粗糙，整個分生孢子類似球拍狀。由此可鑒定J-4、J-15、J-16霉菌為黃曲霉菌(Aspergillusflavus)。

2.7 J-6、J-7、J-12霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)

J-6、J-7、J-12霉菌的菌落特征及分生孢子形態(tài)如圖6所示，其菌落在PDA培養(yǎng)基上的菌落快速生長且無定型，為暗黃綠色，菌絲呈絨毛狀，上有粉末顆粒，質(zhì)地緊密，表面干燥，有不明顯的同心環(huán)，中心凸起，菌落背面無色；在CA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)10～15 mm，菌落為絨狀，中心呈深棕色，邊緣逐漸變土黃色，菌落背面平坦且無色；在CYA培養(yǎng)基上菌落快速生長，無定型，呈赭紅色，質(zhì)地緊密，菌絲體上附著著大量的顆粒，表面有較多的放射狀皺紋，菌落背面呈深赭紅色。菌絲體細(xì)長且無隔，頂端有球狀孢子囊，分生孢子梗生于基質(zhì)，分生孢子球形或近球形，疏松柱狀排列。由此可鑒定J-6、J-7、J-12霉菌為赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。

2.8 不同霉菌對果實軟化的影響

貯藏35 d后，不同霉菌侵染對藍(lán)莓果實軟化的影響如圖7所示，從試驗結(jié)果可以看出，圓弧青霉、層出鐮孢菌、黃曲霉和赭曲霉菌侵染后果實大面積凹陷，軟化程度較高，甚至出現(xiàn)了霉斑，而總狀毛霉菌和擴(kuò)展青霉侵染后對藍(lán)莓果實硬度的影響較弱，幾乎與對照(CK)相似。因此，圓弧青霉、層出鐮孢菌、黃曲霉(Aspergillusflavus)和赭曲霉菌是導(dǎo)致冷藏藍(lán)莓果實軟化的主要侵染霉菌。

3 結(jié)果與討論

霉菌侵染是導(dǎo)致藍(lán)莓果實貯藏品質(zhì)下降的一個重要因素。本研究從已經(jīng)軟化霉腐的藍(lán)莓果實表面分離純化得到了17株霉菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定確定它們?yōu)閷映鲧犳呔?Fusariumprolifertum)、總狀毛霉菌(Mucorracemosus)、圓弧青霉(Penicillumcyclopium)、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)、黃曲霉菌(Aspergillusflavus)和赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。同時，通過人工接種明確了圓弧青霉(Penicillumcyclopium)、層出鐮刀孢霉(Fusariumprolifertum)、黃曲霉(Aspergillusflavus)和赭曲霉(Aspergillus ochraceus)是導(dǎo)致冷藏藍(lán)莓果實軟化的主要侵染霉菌。

不同地區(qū)，不同品種的藍(lán)莓，分離出的病菌種類也有所不同。美國北卡羅來納州、智利中南部、以及加利福尼亞州藍(lán)莓采后侵染的主要致腐霉菌分別是鏈格孢菌(Alternariasp.)、莖潰瘍病菌(Diaportheaustralafricana)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)[13～15]。 我國貴州地區(qū)藍(lán)莓的主要致腐霉菌是青霉菌(Penicilliumsp.)、擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)和枝孢霉(Acremoniumsp.)，而云南地區(qū)的主要是枝孢霉(Acremoniumsp.)、鏈格孢菌(Alternariasp.)和匍柄霉屬(Stemphyliumsp.)[16]。戴啟東等的研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)、鏈格孢菌(Alternariasp.)、青霉菌(Penicilliumsp.)和粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)是遼南地區(qū)藍(lán)莓采后的主要致腐霉菌[17]。吳媛媛等研究認(rèn)為，灰霉菌侵染加速了藍(lán)莓采后果實硬度的下降[18]。由此，應(yīng)有針對性地進(jìn)行調(diào)研，明確當(dāng)?shù)乩洳仄陂g藍(lán)莓果實致腐霉菌的種類及侵染特性，為藍(lán)莓采后貯藏保鮮提供指導(dǎo)。