劉文倩，許 亮，錢立偉，徐甜甜，陳昊楠，張素風(fēng)

(陜西科技大學(xué) 輕化工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021)

0 引言

近十幾年來，在生物技術(shù)和生命科學(xué)領(lǐng)域，大量的研究致力于蛋白質(zhì)藥物的研發(fā)、醫(yī)學(xué)診斷以及基于蛋白質(zhì)組學(xué)的重大疾病發(fā)病機(jī)制的探究，在這些研究中，蛋白質(zhì)的純化、分離與檢測至關(guān)重要[1].為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離或分析，基于抗體-抗原特異性識(shí)別作用的方法是被認(rèn)為最有效的方法，如免疫親和色譜和酶偶聯(lián)免疫吸附劑分析.然而，抗體的篩選與生產(chǎn)十分復(fù)雜，其成本較高，穩(wěn)定性差，不易貯存，所以價(jià)格十分昂貴[2].因此，研究廉價(jià)、穩(wěn)定、可反復(fù)使用的識(shí)別分離材料來取代生物抗體非常重要.

其中，以蛋白質(zhì)為模板的分子印跡技術(shù)被認(rèn)為是最有希望的一種方法[3].分子印跡技術(shù)是創(chuàng)造一種對(duì)模板分子在形狀、大小以及官能團(tuán)具有相互匹配功能的識(shí)別性材料的過程，合成的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)對(duì)模板分子具有較高的親和力和選擇性[4-6].MIPs是通過聚合物中構(gòu)筑與模板分子形狀、大小以及官能團(tuán)具有相互匹配功能的印跡孔穴，來實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的識(shí)別.在分子印跡領(lǐng)域中，以小分子為模板的分子印跡技術(shù)發(fā)展較為成熟[7-9]，與之相比，以生物大分子為模板，特別是蛋白質(zhì)分子，由于其龐大的分子體積使得高識(shí)別性蛋白印跡材料的制備依然面臨許多挑戰(zhàn).

近些年來，將模板固定化法與表面印跡技術(shù)結(jié)合的蛋白MIPs制備策略成為熱點(diǎn)[10].這是因?yàn)椋?1)通過蛋白的固定化，使其位于基質(zhì)材料表面相似位置與高度，因而有利于實(shí)現(xiàn)印跡層厚度與識(shí)別性、模板洗脫能力之間的規(guī)律調(diào)控；(2)通過調(diào)節(jié)基質(zhì)表面官能團(tuán)種類和數(shù)目，可有效增強(qiáng)蛋白的固載量，從而提高蛋白MIPs中印跡孔穴數(shù)目與識(shí)別性.我們研究的意義是尋求一種簡單高效的、適用于蛋白質(zhì)等大分子的印跡策略，為蛋白質(zhì)等大分子的純化、分離與檢測提供新的思路和方法.

分子印跡技術(shù)被認(rèn)為是在模板存在下，功能單體與交聯(lián)劑共聚制備人工受體的最有利技術(shù)之一，然而，相較于印跡效果良好的小分子模板，生物大分子蛋白由于具有結(jié)構(gòu)易變性、分子尺寸大和復(fù)雜的表面結(jié)構(gòu)等特性，其成功的印跡仍面臨許多挑戰(zhàn).針對(duì)這些問題，設(shè)計(jì)了多種策略來解決這些局限性，如原位印跡，微接觸印跡和表面印跡.在這些方法中，表面印跡技術(shù)近年來受到了越來越多的關(guān)注.

本文采用模板固定化策略和表面印跡技術(shù)相結(jié)合的方法，選用蛋白負(fù)載量高的碳納米微球用于蛋白固定化作為分子印跡聚合物的載體，選擇聚合可控、能發(fā)生自聚合作用的多巴胺為功能單體來印跡蛋白質(zhì)，固定化策略可以使目標(biāo)蛋白定向富集在材料表面，得到的印跡孔穴較為規(guī)整，表面印跡技術(shù)使其印跡空穴位于表面，利于模板蛋白的傳質(zhì)過程，最終得到對(duì)目標(biāo)蛋白具有高識(shí)別性能、良好吸附性量的印跡識(shí)別材料.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料及儀器

(1)主要原料

實(shí)驗(yàn)所有原料及試劑見表1所示.

表1 材料、試劑及其規(guī)格

(2)主要儀器

傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克Bruker；掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN；X射線光電子能譜分析儀，英國島津；紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；Zeta電位測定儀，德國Mutek；SDS-PAGE凝膠電泳儀，北京六一儀器廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羧基功能化碳納米微球的制備(CFCs)

先將3 g葡萄糖溶解在30 mL去離子水中，然后加入不同濃度(相對(duì)于葡萄糖劑量為0 wt%、1 wt%、2 wt%、5 wt%、10 wt%和20 wt%)的丙烯酸.然后將反應(yīng)混合物在190 ℃的條件下加水熱處理5 h，得到的物料用水和乙醇洗兩次，在60 ℃的條件下于真空條件下烘干，獲得的樣品[11].

1.2.2 蛋白印跡聚合物的制備(CFC@MIPs)

為制備溶菌酶表面印跡微球，首先將0.04 g CFCs在溶菌酶濃度為1.2 mg/mL的10 mL Tris-HCl緩沖液(0.01 M，pH 8.5)中孵育，室溫下攪拌30 min，得到預(yù)反應(yīng)溶液.接下來，將0.2 g多巴胺添加到溶液中在25 ℃下反應(yīng)40 min.所得產(chǎn)品被混合溶液的2%(v/v)醋酸和2%(w/v)SDS去除模板,直到紫外線分光光度計(jì)在280 nm沒有探測到吸附的蛋白質(zhì)信號(hào).所得到的印跡聚合物(CFC@MIPs)用水和乙醇洗滌數(shù)次，最后在60 ℃真空干燥備用.作為參考，非印跡聚合物(CFC@NIPs)以與CFC@MIPs相同的方法制備，但不添加模板蛋白.

1.2.3 溶菌酶濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以水作溶劑，配制0.1～1.2 mg/L不同濃度的溶菌酶水溶液，以水作參比，測定各濃度溶液在最大吸收波長(280 nm)下的紫外吸收強(qiáng)度，并繪制溶菌酶濃度-吸光度(Abs)標(biāo)準(zhǔn)曲線[12].

1.2.4 吸附實(shí)驗(yàn)表征

(1)吸附量計(jì)算

將測定的上清液的紫外吸光度在濃度-紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線上標(biāo)定，計(jì)算上清液蛋白質(zhì)濃度，用式(1)計(jì)算溶菌酶吸附量[13,14].

(1)

式(1)中：q-吸附量，mg/g；C0-初始濃度，mg/L；Ct-吸附后的濃度mg/L；V-體積，L；m-吸附劑質(zhì)量，g.

(2)吸附動(dòng)力學(xué)

為了研究顆粒的吸附動(dòng)力學(xué)，將10 mg的CFC@MIPs(NIPs)懸浮于含10 mL 1.1 mg/mL的溶菌酶磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH7.0)中.按規(guī)定時(shí)間間隔，在25 ℃下孵育10～110 min，從溶液中離心樣品.用紫外可見分光光度計(jì)在280 nm檢測波長下測定了殘液中溶菌酶的濃度，并用準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以得到最合適的描述.

(3)吸附等溫線

在吸附等溫實(shí)驗(yàn)中，使用不同初始濃度的溶菌酶進(jìn)行了測試，從0.1～1.2 mg/mL在25 ℃下孵化110 min后，離心分離后，用紫外可見分光光度計(jì)在280 nm檢測波長下測定了上清液中溶菌酶的濃度，并用Langmiur和Freundlich模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以得到最合適的描述.

(4)選擇性吸附

在選擇性吸附實(shí)驗(yàn)中，將25 mg CFC@MIP(NIPs)添加到離心管中，該離心管中含有25 mL 濃度為1.1 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液.在溫育110 min后，將溶液通過離心分離，并使用紫外可見分光光度計(jì)測量上清液中蛋白質(zhì)的濃度.

(5)競爭吸附

在競爭性吸附實(shí)驗(yàn)中，有10 mg顆粒放入10 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH 7.0)中，每種濃度的BSA和溶菌酶的蛋白質(zhì)混合物1.0 mg/mL，在25 ℃下.孵育120 min后，將顆粒用2%(v/v)乙酸和2%(w/v)SDS的混合溶液洗滌去除模板蛋白直到紫外可見分光光度計(jì)在280 nm處檢測不到蛋白吸附信號(hào).合并蛋白洗脫液，并使用帶有分子截止值為500 Da透析，然后冷凍干燥.將獲得的產(chǎn)物溶于3 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 M，pH 7.0)，并使用12.5%聚丙烯酰胺分離凝膠和5%聚丙烯酰胺堆積凝膠進(jìn)行SDS-PAGE測量.

2 結(jié)果與討論

本研究以葡萄糖為原料，以水熱碳化制備的碳納米微球?yàn)榈鞍子≯E的載體，以多巴胺作為功能單體和交聯(lián)劑，將模板蛋白固定化策略與表面印跡技術(shù)相結(jié)合，制備了溶菌酶印跡核殼碳微球.在MIPs的制備過程中，通過調(diào)節(jié)丙烯酸的用量和多巴胺的聚合時(shí)間，可以方便地控制碳微球基質(zhì)上羧基的含量和印跡聚合物的厚度.因此，制備的溶菌酶印跡微球在理論上可以表現(xiàn)出優(yōu)異的識(shí)別能力和良好的吸附性能.

2.1 以碳納米微球?yàn)檩d體的蛋白印跡聚合物的表征

2.1.1 丙烯酸添加量對(duì)蛋白固定量的影響

對(duì)于羧基功能化碳微球基質(zhì)，丙烯酸用量是控制其表面電荷、形貌和蛋白固定化能力的重要參數(shù).如圖1所示，隨著丙烯酸用量從0～2 wt%的增加，CFCs的負(fù)表面電荷顯著增加.但碳球上溶菌酶的固定化量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在2 wt%的丙烯酸用量下，最大固定化量約為59 mg/g.這可能是由于丙烯酸的過量，會(huì)導(dǎo)致羧基功能化碳納米微球之間的交聯(lián)和粘附，從而減少了基體中結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量.

圖1 丙烯酸添加量對(duì)碳球表面電荷和蛋白固定化影響

2.1.2 形貌表征

圖2所示的SEM圖像顯示了CFCs、CFC@MIPs和CFC@NIPs的形態(tài)學(xué)特征.如圖2(a)～(c)所示，CFCs、CFC@MIPs和CFC@NIPs的SEM證實(shí)了單分散納米顆粒具有明確的球形形狀和300～500 nm范圍內(nèi)的平均粒徑.此外，圖2(b)、(c)的SEM圖像顯示，與CFCs相比，CFC@MIPs和CFC@NIPs均表現(xiàn)出團(tuán)聚現(xiàn)象，這可能是由于碳球表面包覆了一層聚多巴所導(dǎo)致的.此外，由于碳球基體的電子密度與印跡層相近，而印紋層的厚度又很薄，因此很難對(duì)印跡層厚度的準(zhǔn)確厚度進(jìn)行評(píng)估.

(a)CFCs

2.1.3 結(jié)構(gòu)表征

由圖3(a)全反射紅外光譜圖可以看出，與CFCs相比CFC@MIPs和CFC@NIPs在3 400 cm-1左右的峰變寬，這是由于PDA中羥基吸附水和氨基重疊造成的；此外，在1 506 cm-1和1 645 cm-1分別對(duì)應(yīng)于CFC@MIPs和CFC@NIPs中PDA苯基C=C拉伸和N-H彎曲的典型特征峰[15]，證明多巴胺成功包覆于碳納米微球上，成功制備了蛋白印跡材料和非印跡材料.采用XPS法對(duì)印跡聚合物的表面化學(xué)成分進(jìn)行了表征，通過XPS分析確定了0～1 200 eV范圍內(nèi)的碳(C)、氧(O)和氮(N)元素.

如圖3(b)所示，CFCs中沒有氮的信號(hào)，但是在DA自聚合后，N峰值出現(xiàn)在CFC@MIPs和CFC@NIPs中的400.84 eV處，這與PDA中氮元素所對(duì)應(yīng)，進(jìn)而說明了CFC@MIPs和CFC@NIPs的成功合成.

(a)FT-IR圖

2.2 溶菌酶印跡聚合物吸附性能表征

2.2.1 溶菌酶濃度-吸光度(Abs)標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過紫外分光光度法測得溫度為25 ℃,pH值為7時(shí)，不同濃度下溶菌酶水溶液的吸光度，從而制得溶菌酶溶液-吸光度(Abs)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)曲線進(jìn)行線性擬合，如圖4所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合后方程表示為y=2.293 6x+0.073 2,R2=0.998 4.

圖4 溶菌酶濃度-吸光度(Abs)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 多巴胺聚合時(shí)間對(duì)印跡效果的影響

在表面印跡技術(shù)中，印跡層的厚度是影響MIPs識(shí)別能力的重要因素，因此本文研究了多巴胺聚合時(shí)間對(duì)CFC@MIPs識(shí)別的影響[16-18].如圖5所示，聚合時(shí)間不到40 min的時(shí)候,識(shí)別能力CFC@MIPs隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而顯著增加,表明聚多巴胺層的增厚的初始階段聚合有利于建設(shè)更完整的印跡腔，從而達(dá)到更好的識(shí)別能力.但隨著聚合時(shí)間的延長，CFC@MIPs的識(shí)別能力下降.這可能是由于印跡層太厚，這很容易導(dǎo)致模板分子包埋難以洗脫，減少了印跡腔的數(shù)量.因此，為了獲得最佳的識(shí)別能力，選擇40 min的聚合時(shí)間作為制備CFC@MIPs的最佳反應(yīng)條件.

圖5 多巴胺聚合時(shí)間對(duì)印跡效果的影響

2.2.3 吸附動(dòng)力學(xué)研究

為了確定接觸時(shí)間對(duì)吸附容量的影響，分別對(duì)CFC@MIPs和CFC@NIPs微球的吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了評(píng)價(jià).如圖6所示，在1～100 min內(nèi)，印跡微球的吸附速度比非印跡微球更快.這表明，CFC@MIPs和溶菌酶之間的相互作用明顯強(qiáng)于CFC@NIPs，這很可能是印跡微球內(nèi)存在溶菌酶形狀的印跡孔穴.吸附100 min后，CFC@MIPs和CFC@NIPs的吸附速率均逐漸降低，說明微球內(nèi)外部環(huán)境的驅(qū)動(dòng)力降低.此外，值得注意的是，印跡和非印跡微球均能在110 min內(nèi)達(dá)到平衡，這可能與表面印跡技術(shù)制備的吸附劑傳質(zhì)阻力低有關(guān).因此，在接下來的吸附研究中，CFC@MIPs和CFC@NIPs接觸時(shí)間均選擇了110 min.

圖6 不同接觸時(shí)間內(nèi)CFC@MIPs和CFC@NIPs吸附性能對(duì)比

為了進(jìn)一步研究CFC@MIPs的吸附和識(shí)別行為，建立了準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以期得到最適合的描述.準(zhǔn)一級(jí)模型與準(zhǔn)二級(jí)模型公式如式(2)、(3)所示[19，20]：

ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t

(2)

(3)

式(2)、(3)中：Qe(mg/g)和Qt(mg/g)分別為平衡時(shí)刻和不同時(shí)刻對(duì)應(yīng)的吸附容量.k1(min-1)和k2(mg·g-1min-1)分別是準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)吸附速率常數(shù).準(zhǔn)一階模型描述了吸附位點(diǎn)的占用率與未占據(jù)位點(diǎn)的數(shù)量成正比，而準(zhǔn)二階模型則是吸附質(zhì)與吸附質(zhì)的化學(xué)吸附量的總和.

CFC@MIPs在溫度為25 ℃，pH值為7時(shí)，對(duì)濃度為1.1 mg/g的溶菌酶吸附動(dòng)力學(xué)準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果如圖7和圖8所示，擬合結(jié)果總結(jié)如表1所示.

圖7 CFC@MIPs和CFC@NIPs的準(zhǔn)一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合

圖8 CFC@MIPs和CFC@NIPs的準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合

表1 吸附動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)

如表1所示，CFC@MIPs和CFC@NIPs的偽二階模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好，R2值比偽一階模型高，表明吸附可能是由于化學(xué)吸附.此外，CFC@MIPs的Qe值明顯大于CFC@NIPs，說明它們對(duì)溶菌酶有良好的印跡作用.

2.2.4 等溫吸附研究

為了研究初始濃度對(duì)吸附容量和識(shí)別能力的影響，對(duì)MIPs和NIPs樣品進(jìn)行吸附等溫線實(shí)驗(yàn).從圖9可以看出，隨著溶菌酶濃度從0.1增加到1.0 mg/mL，CFC@MIPs的吸附量迅速增加，在1.1 mg/mL以上達(dá)到了71 mg/g的飽和吸附能力.另外，CFC@MIPs吸附的溶菌酶量明顯高于CFC@NIPs，1.1 mg/mL溶菌酶溶液的最大IF值也達(dá)到3.3.在隨后的吸附實(shí)驗(yàn)中，選擇溶菌酶濃度為1.1 mg/mL，識(shí)別效果最佳.

圖9 溶菌酶不同初始濃度下CFC@MIPs(NIPs)吸附性能對(duì)比

為了進(jìn)一步研究CFC@MIPs和CFC@NIPs對(duì)溶菌酶的吸附和識(shí)別機(jī)制，分別采用Langmuir模型和Freundlich模型對(duì)吸附等溫曲線進(jìn)行分析.Langmuir等溫線模型假設(shè)吸附發(fā)生在特定的均相位點(diǎn)和單層吸附，每個(gè)位點(diǎn)只能吸附一個(gè)分子，而Freundlich等溫線模型適用于非均相表面的多層吸附.這些模型表示如式(4)、(5)所示[21，22]

(4)

(5)

式(4)、(5)中：qm(mg/g)和Kl(mL/mg)分別為理論最大吸附容量和結(jié)合極限的Langmuir常數(shù).Kf(mg/g)是與吸附能力有關(guān)的Freundlich常數(shù).

CFC@MIPs和CFC@NIPs在溫度為25 ℃，pH值為7時(shí)，對(duì)不同濃度的溶菌酶吸附Langmuir模型結(jié)果如圖10所示.它們?cè)跍囟葹?5 ℃，pH值為7時(shí)，對(duì)不同濃度的溶菌酶吸附Freundlich模型結(jié)果如圖11所示，擬合結(jié)果如表2所示.

圖10 CFC@MIPs和CFC@NIPs的Langmuir吸附等溫模型擬合

圖11 CFC@MIPs和CFC@NIPs的Freundlich吸附等溫模型擬合

如表2所示，與Freundlich模型擬合結(jié)果相比，CFC@MIPs和CFC@NIPs的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Langmuir模型擬合較好，R2都大于0.98，說明兩種材料對(duì)溶菌酶的吸附過程類似于單分子層吸附，并且材料中的吸附位點(diǎn)分布較為均勻，進(jìn)一步證實(shí)了CFC@MIPs中存在溶菌酶大小的印跡空腔.

表2 吸附等溫線擬合參數(shù)

2.2.5 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

選擇幾種蛋白包括卵清白蛋白(Mw=43 kDa，pI=4.5)，牛血紅蛋白(Mw=65 kDa，pI=6.9)，牛血清白蛋白(Mw=66.4 kDa，pI=4.8)和細(xì)胞色素C(Mw=13 kDa，pI=10.8)作為參比蛋白，以研究CFC@MIPs和CFC@NIPs對(duì)溶菌酶的識(shí)別能力.如圖12所示，CFC@MIPs可以選擇性地吸附溶菌酶，印跡因子可達(dá)3.3.但是，仍然可以觀察到有一些牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C與MIPs結(jié)合，這可能是由于π-π堆積，氫鍵和蛋白質(zhì)和聚多巴胺層之間的靜電相互作用.此外，與牛血紅蛋白和細(xì)胞色素C相比，CFC@MIPs吸附牛血清白蛋白和卵清白蛋白的容量更少，說明兩者之間存在較強(qiáng)的靜電排斥作用[23].

圖12 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

2.2.6 競爭吸附

通過競爭吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了MIPs在蛋白混合溶液中對(duì)溶菌酶的識(shí)別能力.從圖13可以看出，在SDS-PAGE分析中，泳道4的兩條明顯的條帶顯示了NIPs可以通過非特異性吸附提取牛血清白蛋白(Mw=66.4 kDa，pI=4.8)和溶菌酶(Mw=14.4 kDa，pI=11.2).然而，與NIPs相比，只在泳道3中發(fā)現(xiàn)了一條條帶，且顏色更深，而在14.4 kDa處代表溶菌酶，進(jìn)一步說明MIPs表現(xiàn)出了良好的特異性識(shí)別能力.從SDS-PAGE分析結(jié)果可以推斷，CFC@MIPs納米顆粒具有大量與模板蛋白溶菌酶互補(bǔ)的印跡空腔.

條帶1為蛋白質(zhì)Marker；條帶2為溶菌酶和牛血清白蛋白的混合蛋白溶液：條帶3和4分別為從CFC@MIPs和CFC@NIPs中得到的洗脫蛋白圖13 SDS-PAFE凝膠電泳分析

3 結(jié)論

對(duì)基于羧基功能化的碳納米微球?yàn)檩d體的蛋白印跡聚合物通過掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線光電子能譜分析儀(XPS)和傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)進(jìn)行了物理和化學(xué)性能檢測及分析，可以證實(shí)多巴胺成功包覆于羧基功能化碳納米微球表面，成功制備了溶菌酶蛋白印跡聚合物.

吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在溫度為25 ℃、pH為7的環(huán)境下，該印跡納米材料對(duì)目標(biāo)蛋白有較高的吸附能力，吸附量為71 mg/g，快速平衡時(shí)間為110 min，溶菌酶印跡聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，等溫吸附數(shù)據(jù)符合Langmuir模型，吸附屬于化學(xué)單層吸附，且對(duì)目標(biāo)蛋白有較好的選擇性，印跡因子可達(dá)3.3.