王璐,鄒應芬,賈浩源

南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇無錫214023

哮喘患者反復發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和咳嗽給患者造成極大的痛苦，估計到2025年全球約有哮喘患者4億[1]。哮喘發(fā)病機制主要是過敏反應、炎癥/免疫細胞和氣道高反應之間相互作用，導致支氣管收縮，最終氣道重構。哮喘的慢性變應性炎癥涉及到多種細胞(如樹突狀細胞、B細胞、T細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和肥大細胞)及炎癥因子(主要是Th2樣細胞因子)[2]。目前還沒有一種治療方法能夠加速受損肺部的修復。

間充質(zhì)干細胞(MSC)是具有自我更新能力的多能祖細胞，其來源廣泛，且能夠分化為多種細胞，如BM-MSCs、 AD-MSCs、UCB-MSCs等，這些細胞具有組織修復潛力，是免疫反應的主要調(diào)節(jié)者[3]。外泌體是一種由真核細胞分泌并釋放到胞外環(huán)境中的納米級膜性囊泡，可作為細胞間信息交流的傳遞使者通過表面分子與受體細胞表面受體結(jié)合，將其內(nèi)含物遞送給受體細胞[4]。人臍帶間充質(zhì)干細胞源性外泌體(hucMSC-ex)是間充質(zhì)干細胞分泌的小囊泡，其易獲得且能夠模擬hucMSC生物學功能，具有促進組織修復或免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。因此認為，hucMSC-ex可能對哮喘有治療作用。為驗證此猜測，2018年1月～2019年12月，我們首先分離培養(yǎng)hucMSC，提取hucMSC-ex，然后采用卵蛋白致敏的方式構建小鼠哮喘模型，在小鼠哮喘模型制作的過程中尾靜脈注射hucMSC-ex，觀察肺組織炎癥細胞及血清炎性因子的變化，以探討hucMSC-ex對哮喘小鼠全身及肺組織炎癥反應的防治作用。

1 材料與方法

1.1 組織、動物及主要試劑與儀器 臍帶組織標本來源于無錫市人民醫(yī)院。BALB/c雌性小鼠 6～8周30只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。小鼠放置在標準的實驗室條件下[光照12 h，黑暗12 h，(21±2)°C] 進行飼養(yǎng)。α-MEM培養(yǎng)基(hyclone)，特級胎牛血清(FBS)(bioind， 南美)，35 mm細胞培養(yǎng)皿(corning，美國)，100 kDa MWCO 超濾離心管(Millipore 公司，美國)，細胞上清 ExoQuick 提取試劑盒(SBI 公司，美國)，ELISA試劑盒(ImmunoWay)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 公司，美國)。

1.2 hucMSCs的分離培養(yǎng)及外泌體的分離 根據(jù)前期建立的貼壁培養(yǎng)法[5]分離培養(yǎng)hucMSCs 。選取P2～P7代對數(shù)生長期的hucMSCs無血清外泌體培養(yǎng)上清，根據(jù)SBI試劑盒的說明書提取hucMSCs來源的外泌體。透射電鏡結(jié)果顯示hucMSC-ex為大小均一的囊泡，Nanosight結(jié)果顯示hucMSC-ex分布在50～200 nm之間，直徑大約為110 nm，符合hucMSC-ex的特征，因此鑒定為hucMSC-ex。

1.3 小鼠哮喘模型的構建、分組及hucMSC-ex的注射 BALB/c雌性小鼠第0天和第7天腹腔注射10%的卵蛋白和氫氧化鋁混合液1 mL進行致敏。1周后將小鼠隨機分為hucMSC-ex組、哮喘組、對照組各10只。將小鼠置于20 cm×30 cm×40 cm霧化箱內(nèi)，hucMSC-ex組霧化吸入1%卵蛋白10 mL，每日1次，每次30 min，持續(xù)2周，并于每次霧化前尾靜脈注射200 μg/mL的hucMSC-ex。哮喘組尾靜脈注射hucMSC-ex同體積的PBS后，霧化吸入1%卵蛋白10 mL，每日1次，每次30 min，持續(xù)2周。對照組霧化吸入10 mL PBS，每日1次，每次30 min，持續(xù)2周。

1.4 各組肺組織病理變化觀察 末次激發(fā)結(jié)束48 h后將小鼠進行麻醉，暴露胸腔，取出左肺，將其固定后制作石蠟切片，進行HE染色并在顯微鏡下觀察其病理改變。

1.5 各組肺泡灌洗液(BALF)中白細胞分類計數(shù) 末次激發(fā)結(jié)束48 h后將小鼠進行麻醉，對各組大鼠經(jīng)氣管緩慢注射300 μL生理鹽水到右肺，進行回抽，重復3次后獲得BALF，進一步進行瑞氏染色，顯微鏡下觀察200個高倍視野，對細胞進行計數(shù)，并根據(jù)細胞形態(tài)對細胞進行分類統(tǒng)計。

1.6 各組血清中IL-4、IL-5、IL-13的檢測 采用ELISA法。末次激發(fā)結(jié)束48 h后將小鼠進行麻醉，用移液器經(jīng)眼眶后靜脈叢采血并及時分離血清。根據(jù)試劑盒說明書建立標準曲線，檢測血清中IL-4、IL-5、IL-13。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理變化 與對照組相比，哮喘組氣道壁增厚，管腔不規(guī)則，氣道周圍炎癥細胞浸潤明顯增加，氣道周圍水腫明顯加重；與哮喘組比較，hucMSC-ex組肺組織氣管黏膜增厚情況及水腫減輕，細胞變性和炎癥浸潤減少(見圖1)。

圖1 肺組織病理結(jié)構(HE染色，×20)

2.2 各組BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例比較 與對照組相比，哮喘組白細胞總數(shù)及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例明顯增加；與哮喘組比較，hucMSC-ex組BALF中白細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例降低(P均<0.05)，詳見表1。

表1 各組BALF中白細胞總數(shù)及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例

2.3 各組血清炎癥因子水平比較 與對照組相比，哮喘組血清中IL-4、IL-5、IL-13水平升高；與哮喘組比較，hucMSC-ex組IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P均<0.05)(詳見表2)。

表2 各組血清IL-4、IL-5、IL-13水平

3 討論

哮喘是一種多細胞參與的慢性呼吸道炎癥性疾病。許多研究表明，間質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥反應的作用，MSC可以減輕過敏性哮喘患者的肺部炎癥和組織重塑[6～8]。Bonfield等[9]證明人類BM-MSC能夠降低卵蛋白誘導的哮喘小鼠模型中嗜酸性粒細胞的數(shù)量。這些研究表明在哮喘治療中MSC具有一定的效果，但MSC存在一定的免疫原性，且易在肺部阻塞，體內(nèi)移植存在一定的風險。近期有研究[10]表明，MSCs在哮喘中的免疫調(diào)節(jié)作用主要歸因于其分泌的可溶性因子，而不是其分化潛能。外泌體作為MSCs重要的旁分泌介質(zhì)不僅免疫原性低，且具有一定的趨化作用，它可以包含MSC源的多種RNA、蛋白和脂質(zhì)，并將其傳遞給靶細胞模仿MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用[11]。經(jīng)過蛋白質(zhì)譜分析和微小RNA測序分子發(fā)現(xiàn)，hucMSC-ex中包含有豐富的蛋白及mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA。前期研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外模型中hucMSC-ex能夠預防順鉑誘導的急性腎損傷，進一步研究[5]發(fā)現(xiàn)其通過轉(zhuǎn)運14-3-3ζ蛋白到達腎小管上皮細胞調(diào)節(jié)細胞自噬發(fā)揮保護作用。此外hucMSC-ex高表達let-7b，通過將其轉(zhuǎn)運到肝臟星狀細胞調(diào)控TGF-βR1的表達，抑制膠原的合成從而緩解肝纖維化。以上研究表明外泌體作為一種生物活性介質(zhì)發(fā)揮著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-ex能夠有效地降低肺部組織炎癥浸潤情況，降低BALF中白細胞總數(shù)以及嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的比例。提示hucMSC-ex對小鼠哮喘有治療作用。

有研究[12]報道，BM-MSC驅(qū)動的免疫調(diào)節(jié)是通過抑制促炎Th1反應，同時使Th1/Th2向Th2方向重新平衡而介導的。Kavanagh 等[13]發(fā)現(xiàn)，BM-MSC通過產(chǎn)生TGF-β和向肺部招募調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)以抑制Th2驅(qū)動的過敏反應。Th2樣細胞因子IL-4能夠促進IgE產(chǎn)生，然后與嗜堿性粒細胞和肥大細胞上FCεRⅠ結(jié)合，當再次接觸過敏原時能夠?qū)е麓罅拷M胺釋放，增加氣道的通透性。IL-5通過促進嗜酸性粒細胞活化釋放細胞因子破壞上皮層，促進支氣管收縮。IL-13能夠促進杯狀細胞化生與氣道高反應性。有研究表明MSC來源的外泌體能夠上調(diào)外周血單個核細胞IL-10和TGF-β1的水平進而促進Tregs 細胞的增殖和免疫抑制活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-ex能夠降低肺組織分泌到循環(huán)血液中的IL-4、IL-5、IL-13的水平，表明hucMSC-ex能夠有效防治哮喘小鼠肺部及全身的炎癥反應，防止疾病的進一步進展。

綜上所述，卵蛋白誘導哮喘過程中尾靜脈注射hucMSC-ex的小鼠肺部及全身炎癥反應減輕，hucMSC-ex能夠防治小鼠肺部及全身炎癥反應，改善哮喘癥狀，可能是一種新的治療哮喘的選擇。但是，hucMSC-ex是如何改善哮喘引發(fā)的炎癥反應，傳遞何種分子發(fā)揮作用需要后續(xù)試驗進一步探討研究。