付兵，王美，劉建陽，林偉，張成省，趙棟霖

海洋來源雜色曲霉次級代謝產(chǎn)物及其抗植物病原細(xì)菌活性

付兵1,2，王美1，劉建陽2，林偉2，張成省1，趙棟霖1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心，山東青島 266101；2福建省煙草公司南平市公司，福建南平 353000）

【目的】針對植物細(xì)菌病害日趨嚴(yán)重，并缺少有效防治藥劑的問題，從前期篩選獲得的具有抗菌活性且次級代謝產(chǎn)物豐富的海洋雜色曲霉（）D5發(fā)酵提取物中分離純化單體化合物，分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行抗菌活性評價，闡明目標(biāo)真菌的抗菌活性成分，為新穎結(jié)構(gòu)抗細(xì)菌生物農(nóng)藥的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物?！痉椒ā烤C合運(yùn)用正/反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析和半制備高效液相色譜（HPLC）等方法分離純化單體化合物，采用核磁、質(zhì)譜等現(xiàn)代波譜分析方法對單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；采用微量稀釋法對化合物進(jìn)行抗6種植物病原細(xì)菌燕麥?zhǔn)乘峋ǎ⒑}卜軟腐歐文氏菌（）、密執(zhí)安棒形桿菌（）、丁香假單胞菌（）、青枯雷爾氏菌（）和野油菜黃單胞菌（）活性評價，獲得活性化合物的最小抑菌濃度（MIC）?！窘Y(jié)果】從海洋雜色曲霉D5馬鈴薯葡萄糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基乙酸乙酯提取物中分離鑒定了12個化合物，包括4個2-羰基-4-苯基喹啉生物堿，viridicatin（1）、3--methylviridicatin（2）、3,6--dimethylviridicatin（3）和3--methylviridicatol（4）；2個雙氧代哌嗪生物堿，（+）-cyclopenol（5）和（?）-cyclopenol（6）；3個喹唑啉fumiquinazolines生物堿及其衍生物，versicoloid A（7）、chrysopiperazine C（8）和cottoquinazoline A（9）；以及3個蒽醌類化合物，versiconol（10）、averufin（11）和noraverufanin（12）?？咕钚越Y(jié)果表明，2-羰基-4-苯基喹啉生物堿3,6--dimethylviridicatin（3）具有顯著的抗植物病原細(xì)菌活性，對青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的MIC分別為50和100 μg·mL-1。初步的構(gòu)效關(guān)系分析表明，C-6位置的甲氧基可能是該類化合物發(fā)揮抗植物病原細(xì)菌作用的關(guān)鍵基團(tuán)?！窘Y(jié)論】海洋雜色曲霉D5代謝產(chǎn)物豐富，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的生物堿和蒽醌類化合物。從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了9個生物堿類化合物和3個蒽醌類化合物，其中3,6--dimethylviridicatin（3）對青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌具有顯著的抗菌活性，有開發(fā)成為抗細(xì)菌生物農(nóng)藥的潛力。

海洋真菌；雜色曲霉；生物堿；蒽醌；結(jié)構(gòu)鑒定；植物病原細(xì)菌

0 引言

【研究意義】隨著世界人口數(shù)量的不斷增長，避免饑餓、保障糧食安全顯得尤為重要，因此，需要控制植物病害的發(fā)生，增加和保證糧食的產(chǎn)量[1-2]。植物病原細(xì)菌在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)歷史上曾經(jīng)多次造成重大影響，作物細(xì)菌病害是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、人口數(shù)量下降和社會動蕩的客觀因素之一[3]。已知的植物病原細(xì)菌有200多個屬，其中最重要的包括假單胞菌屬（）、雷爾氏菌屬（）、農(nóng)桿菌屬（）、黃單胞菌屬（）、歐文氏菌屬（）、木質(zhì)部小菌屬（）和果膠桿菌屬（）[4-6]。目前防治植物細(xì)菌病害的方法主要是采用抗病品種、加強(qiáng)田間管理和輪作等方式，但效果有限[4]；防治的藥劑主要為化學(xué)農(nóng)藥，容易造成環(huán)境污染、食品安全和病原抗性等一系列問題[4,7]。一直以來，農(nóng)用硫酸鏈霉素都是我國農(nóng)作物細(xì)菌病害防治的主力軍，而隨著我國停止使用農(nóng)用硫酸鏈霉素，植物細(xì)菌病害的防治面臨巨大挑戰(zhàn)。隨著國家大力推行發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，更加注重環(huán)境友好，研發(fā)新型高效低毒的抗細(xì)菌生物農(nóng)藥迫在眉睫。【前人研究進(jìn)展】眾所周知，海洋真菌由于生活在高鹽、高壓、低溫、低氧、少光和寡營養(yǎng)的海洋環(huán)境中，擁有獨(dú)特的生存策略，經(jīng)過長期的進(jìn)化演變形成了不同于陸地真菌的特殊代謝機(jī)制，能夠產(chǎn)生種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，因而近年來成為研究的熱點(diǎn)[8]。許多海洋真菌次級代謝產(chǎn)物具有明顯的抗細(xì)菌活性，顯示出了作為新型抗細(xì)菌農(nóng)藥的巨大開發(fā)潛力[9]。然而，對于這些化合物的抗細(xì)菌活性研究大多集中在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，關(guān)于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用還很少，但僅有的少量研究展現(xiàn)了極其可觀的研究價值和前景。UCHIDA等[10]從一株未鑒定的海洋真菌發(fā)酵粗提物中分離獲得了兩個聚酮類化合物chlorogentisylquinone和gentisylquinone，它們在10 μg/disk的濃度下對水稻黃單胞菌（）的抑菌圈分別為9和10 mm，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌活性；SWatHI等[11]對海洋來源的一株曲霉（sp.）發(fā)酵提取物進(jìn)行抗菌活性研究，發(fā)現(xiàn)其對野油菜黃單胞菌（）具有較強(qiáng)的抑菌活性，在100 μg·mL-1的濃度下抑菌圈達(dá)到12 mm，有望從中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)活性抗菌化合物；SILBER等從一株海水來源的真菌sp. KF525發(fā)酵液中分離獲得了一個二十四元大環(huán)內(nèi)酯類化合物calcaride A，其對野油菜黃單胞菌顯示了中等強(qiáng)度的抑菌活性，最小抑菌濃度（MIC）為5.5μmol·L-1[12]；隨后，該小組發(fā)現(xiàn)分離自波羅的海和南極海域的兩株Lindgomycetaceae所產(chǎn)聚酮類化合物lindgomycin和ascosetin，對野油菜黃單胞菌的IC50分別為17.8和14.8 μmol·L-1[13]；HENRIQUEZ等[14]從南極海域采集的海綿中分離獲得了101株真菌，發(fā)現(xiàn)其中11株真菌的發(fā)酵提取物對密執(zhí)安棒形桿菌（）具有抑菌活性，22株真菌的提取物對野油菜黃單胞菌表現(xiàn)出了明顯的抑菌活性；NIU等[15]對分離自深海來源真菌sp. MCCC 3A00308的多酚類化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)spiromastols A和C表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗植物病原細(xì)菌活性，對野油菜黃單胞菌、假單胞菌（）、根癌農(nóng)桿菌（）和青枯雷爾氏菌（）的MIC達(dá)到0.25—0.5 μmol·L-1，活性強(qiáng)于陽性藥氯霉素，具有開發(fā)成為抗細(xì)菌農(nóng)藥的潛力；WANG等[16]對一株海膽來源的亮白曲霉（）HDf2進(jìn)行研究，從中獲得了兩個具有抗菌活性的刺孢青霉酸類化合物spiculisporic acid F和G，它們對青枯雷爾氏菌顯示了中等強(qiáng)度的抑菌活性；CHEN等[17]對一株海藻來源的格孢腔菌（sp.）所產(chǎn)混源萜類次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)pleosporallins D和E對密執(zhí)安棒形桿菌顯示了中等活性的抑菌活性，MIC為9.48 μg·mL-1?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組在前期研究中，從山東沿海和海南海洋特殊紅樹林生境中分離純化了200余株海洋真菌，通過初步的形態(tài)學(xué)排重后，對其進(jìn)行了種屬鑒定。對其中近80株真菌進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵，測試其發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物的抗植物病原細(xì)菌活性，篩選得到多株抗菌活性顯著的海洋真菌[18-19]。其中，一株海藻來源的雜色曲霉（）D5，其發(fā)酵提取物對青枯雷爾氏菌等植物病原細(xì)菌表現(xiàn)出了明顯的抗菌活性。HPLC指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，D5次級代謝產(chǎn)物豐富，結(jié)構(gòu)類型多樣，產(chǎn)量較大，有望從中發(fā)現(xiàn)抗菌活性化合物?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從雜色曲霉D5發(fā)酵產(chǎn)物中分離、純化單體化合物，并采用多種譜學(xué)方法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)而對單體化合物進(jìn)行抗植物病原細(xì)菌活性測試并分析構(gòu)效關(guān)系，闡明目標(biāo)菌株的活性成分及活性化合物的關(guān)鍵作用基團(tuán)，為海洋真菌來源高效低毒生物農(nóng)藥的研發(fā)提供化合物基礎(chǔ)。

4.創(chuàng)新活動載體。要提高黨組織的凝聚力和戰(zhàn)斗力，創(chuàng)新活動載體、保證活動成效十分關(guān)鍵。結(jié)合社會組織主要分布在油田各行各業(yè)、在職黨員具有較強(qiáng)的業(yè)務(wù)知識等特點(diǎn)，引導(dǎo)社會組織“適時、適宜、適度”地參與油田各項(xiàng)建設(shè)，引導(dǎo)他們參與油田的各項(xiàng)便民利民服務(wù)，如定期不定期舉辦法律、醫(yī)療保健，家庭理財(cái)?shù)确矫娴淖稍兎?wù)等，并通過建立服務(wù)志愿者隊(duì)伍，把參與結(jié)果作為吸收入黨、評選先進(jìn)的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)，吸引更多的新社會組織從業(yè)人員投入到油田發(fā)展，使越來越多的員工群眾從中受益。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所海洋農(nóng)業(yè)研究中心/灘涂生物資源保護(hù)利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)完成。

Monographic report: Screening and prevention of chronic kidney disease in Shanghai

1.1 儀器與試劑

核磁共振波譜儀Agilent DD2 500（美國安捷倫公司）；質(zhì)譜儀ESI-MS Q-TOF Ultima Global GAA076（美國Waters公司）和Q-TOF maXis（美國Bruker公司）；高效液相色譜儀（日本日立公司）；C18柱：（5 μm，10 mm×250 mm，美國Waters公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Hei-VAP Industrial-glassware set R（德國Heidoph公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；正相柱層析硅膠100—200、200—300目（青島海洋化工廠）；凝膠Sephadex LH-20（美國GE公司）；正相TLC預(yù)制板（煙臺匯有硅膠開發(fā)有限公司）；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；HPLC用甲醇和乙腈為色譜純（國藥集團(tuán)），其他試劑均為分析純。

1.2 菌株發(fā)酵與培養(yǎng)

化合物3為白色晶體，ESIMS質(zhì)譜中在m/z 282.1 [M + H]+處給出分子離子峰，結(jié)合氫譜和碳譜，推測分子式為C17H15NO3，不飽和度為11。仔細(xì)分析其1H-NMR和13C NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)3的核磁數(shù)據(jù)與2十分相似。與2相比，3少了1個芳香氫信號，同時增加了1個甲氧基信號H3.67，C55.5，提示該分子中的1個芳香氫被甲氧基取代。經(jīng)過與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對，確定化合物3為3,6--dimethylviridicatin[23]（圖1）。

1.2.2 菌株發(fā)酵與培養(yǎng) 500 mL的發(fā)酵瓶中倒入250 mL馬鈴薯葡萄糖水（PDW）培養(yǎng)基，滅菌。挑取生長于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上的目標(biāo)菌株加入其中，共發(fā)酵10瓶。搖床（180 r/min，28℃）振蕩培養(yǎng)72 h，獲得種子液。將400 mL PDW培養(yǎng)基加入容量為1 L的發(fā)酵瓶中，加入粗海鹽使其濃度為3%，滅菌，共發(fā)酵80 L。取種子液5 mL分別加入400 mL PDW培養(yǎng)基中，于28℃靜置培養(yǎng)30 d。

加強(qiáng)“吃住行游購?qiáng)省庇布O(shè)施建設(shè)，優(yōu)化健康旅游服務(wù)軟環(huán)境，構(gòu)筑全區(qū)域、全方位、全覆蓋、全過程的配套服務(wù)體系。推進(jìn)“互聯(lián)網(wǎng)+健康旅游”，打造智慧旅游服務(wù)，實(shí)現(xiàn)信息數(shù)據(jù)共享，建立標(biāo)準(zhǔn)化電子健康檔案，保障游客享受旅游服務(wù)的延續(xù)性。構(gòu)建“快進(jìn)慢游”交通網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用北斗、大數(shù)據(jù)分析等技術(shù)，開展旅游交通精準(zhǔn)信息服務(wù)，依托高鐵、民航、高等級公路等建立“快進(jìn)”網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)通達(dá)性和便捷性；建設(shè)風(fēng)景道、自行車道、步行道等“慢游”設(shè)施，打造健康主題線路[17]。

1.3 化合物分離純化

化合物9為淡黃色粉末，ESIMS：m/z 430.2 [M + H]+，結(jié)合其1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C23H19N5O4。1H-NMR在H8.10（1H，d，=8.0 Hz），7.83（1H，t，=7.5 Hz），7.72（1H，d，=8.0 Hz），7.52（1H，t，=7.0 Hz）給出信號，以及7.39（1H，d，=7.5 Hz），7.27（2H，m），7.07（1H，dd，=7.0，4.5 Hz）給出信號，提示分子中存在2個1,2-二取代苯環(huán)。13C-NMR中C167.8、165.6和159.4給出3個酰胺碳信號；低場區(qū)給出13個芳香碳信號；此外還給出了4個次甲基信號，1個亞甲基信號和1個甲基信號。以上數(shù)據(jù)經(jīng)過與文獻(xiàn)進(jìn)行比對，確定化合物9為cottoquinazoline A[26]（圖1）。

1.4 抗菌活性測定

病原細(xì)菌：燕麥?zhǔn)乘峋ǎ?、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（）、密執(zhí)安棒形桿菌、丁香假單胞菌（）、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌。

Divas’ Dream超薄三問腕表采用極其纖薄的37毫米18K玫瑰金表殼，精巧靈動，而圓潤飽滿的扇形表耳則平添了溫婉韻致。表耳上排布著明亮式切割鉆石更顯雍容矚目。18K玫瑰金表冠上鑲嵌著華美的多面切割鉆石，與柔和溫婉的線條相映成輝。這款精美的珠寶腕表，傳承了Divas’ Dream系列以美學(xué)技法與精致格調(diào)為主題不斷演化的魅力，自然需配以華彩奪目的表盤。

采用微量稀釋法，測試化合物對幾種植物病原細(xì)菌的MIC[20]。病原菌振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，并稀釋至106cfu/mL。將待測化合物用DMSO配成10 mg·mL-1母液。每種病原菌采用單獨(dú)的96孔板進(jìn)行測試。在96孔板第1列的第1孔加198 μL菌液，余下2—8孔各加100 μL菌液。吸取2 μL化合物母液加入第1孔，混合均勻。采用二倍稀釋法將1—8孔依次稀釋，即從第一孔中吸取100 μL含藥菌液加入第2孔混勻后，從第2孔吸取100 μL含藥菌液加入第3孔，并混勻，以此類推。到第8孔混勻后，移除100 μL含藥菌液，使每孔都含有100 μL含藥菌液，后再每孔加入100 μL菌液，使每孔體積達(dá)到200 μL。每個化合物重復(fù)3列。用無菌培養(yǎng)基作空白對照，并設(shè)立未加化合物的菌液對照，DMSO作陰性對照，空白對照和陰性對照分別做3個孔，硫酸鏈霉素做陽性對照，測試方法與化合物相同。將96孔板放入生物培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀600 nm波長下測量吸光度，并結(jié)合肉眼觀察，以吸光度出現(xiàn)大幅度變化，且最后一個澄清的孔對應(yīng)的濃度，作為化合物MIC值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H12.11（1H，s，NH-1），7.53（2H，t，=7.5 Hz，H-13，H-15），7.47（1H，t，=7.5 Hz，H-14），7.41（1H，d，=8.5 Hz，H-8），7.37（2H，m，H-12，H-16），7.07（1H，dd，=8.5，2.5 Hz，H-7），6.65（1H，d，=2.5 Hz，H-5），3.83（3H，s，3-OCH3），3.67（3H，s，6-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C160.3（C-2），155.2（C-6），145.7（C-3），138.9（C-4），133.5（C-11），129.9（C-9），129.3（C-12，C-16），128.5（C-13，C-15），128.3（C-14），121.7（C-10），117.5（C-7），117.0（C-8），108.6（C-5），60.3（3-OCH3），55.5（6-OCH3）；ESIMS：m/z 282.1 [M + H]+。

（3）注意整個施工過程的維護(hù)工作，尤其是進(jìn)行防滲漏施工時，涂刷好防水涂料后必須要進(jìn)行一定的防護(hù)，防止后期出現(xiàn)其他問題，影響施工質(zhì)量。

12月13日上午，省自然資源廳召開慶祝改革開放40周年座談會，回顧自然資源工作歷程，展望發(fā)展前景。省自然資源廳黨組書記、廳長李琥參加會議并講話。廳一級巡視員王桂鵬主持。廳領(lǐng)導(dǎo)、廳機(jī)關(guān)和各直屬事業(yè)單位主要負(fù)責(zé)同志、退休老干部及基層代表共130余人參加會議。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CD3OD）：H7.34（2H，m，H-7，H-8），7.31（1H，d，=8.0 Hz，H-15），7.24（1H，d，=8.0 Hz，H-6），7.11（1H，m，H-5），6.87（1H，m，H-14），6.80—6.82（2H，m，H-12，H-16）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）：C160.5（C-2），158.7（C-13），143.0（C-3），136.1（C-4），134.3（C-9），130.6（C-11），128.0（C-15），127.3（C-7），126.3（C-5），123.8（C-6），123.0（C-10），122.1（C-16），117.9（C-12），116.5（C-8），116.0（C-14）；ESIMS：m/z 254.1 [M + H]+。

他在云游時曾發(fā)現(xiàn)，江浙一帶部分僧人宗教生活的全部就是幫人做法事，明碼標(biāo)價，談攏動身，缽滿盈滿的他們不喜歡公開，最直接的一條理由無關(guān)貪腐，而是數(shù)目之咋舌，可能會帶來競爭，“都來當(dāng)和尚怎么辦？”

化合物2為白色晶體，ESIMS：m/z 252.1 [M + H]+，結(jié)合其氫譜和碳譜，推測分子式為C16H13NO2，不飽和度為11。1H NMR譜H12.66處給出1個酰胺氫特征信號，低場區(qū)給出了9個芳香氫信號，以上信息結(jié)合TLC特征，推測2與1為同系列化合物。在13C-NMR中，C161.1提示酰胺碳的存在；在低場區(qū)給出了14個碳信號，包括5個季碳和9個叔碳；C60.4處的信號提示分子中存在1個甲氧基。以上數(shù)據(jù)經(jīng)過與文獻(xiàn)對比，確定化合物2為3-- methylviridicatin[22]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H12.66（1H，s，NH-1），7.53（2H，t，=7.5 Hz，H-13，H-15），7.49（1H，d，=7.5 Hz，H-14），7.45（1H，t，=7.5 Hz，H-7），7.38（2H，d，=7.5 Hz，H-12，H-16），7.23（1H，d，=7.5 Hz，H-5），7.12（1H，t，=7.5 Hz，H-6），3.85（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C161.1（C-2），145.2（C-3），139.4（C-4），135.5（C-9），133.5（C-11），129.4（C-12，C-16），128.8（C-14），128.4（C-13，C-15），128.2（C-7），126.4（C-5），122.6（C-6），120.9（C-10），116.0（C-8），60.4（3-OCH3）；ESIMS：m/z 252.1 [M + H]+。

1.2.1 菌株來源 海洋真菌分離自山東青島沿海一種未鑒定的海藻，通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定方法確定為雜色曲霉D5。菌種于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO. 15386。

化合物1為白色晶體，質(zhì)譜ESIMS給出分子離子峰m/z 254.1 [M + H]+，結(jié)合其氫譜和碳譜，推測其分子式為C15H11NO3，不飽和度為11。在1H NMR中給出了8個芳香氫信號，提示分子中存在2個苯環(huán)。在13C NMR中，低場區(qū)給出了14個芳香碳和烯碳信號以及1個酰胺碳信號C160.5，其中包括2個連氧的sp2雜化碳信號C158.7和143.0，結(jié)合其分子式，提示分子中存在2個羥基。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物viridicatol數(shù)據(jù)一致[21]，故鑒定化合物1為 viridicatol（圖1）。

除了在磷石膏綜合利用方面的協(xié)同發(fā)展外，何光亮還提到兩家企業(yè)還會在磷礦石開采進(jìn)行協(xié)同發(fā)展，他說：“把開磷的采礦技術(shù)和甕福的選礦技術(shù)結(jié)合起來，創(chuàng)造的價值將成倍增長?！蓖瑫r，甕福集團(tuán)的氟提取技術(shù)也會在開磷集團(tuán)應(yīng)用，提高開磷集團(tuán)在氟化工方面的效益。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.07（1H，s，NH-1），9.64（1H，s，15-OH），7.41（1H，t，=7.5 Hz，H-7），7.34（1H，d，=7.5 Hz，H-8），7.30（1H，t，=7.5 Hz，H-13），7.09（1H，t，=7.5 Hz，H-6），7.04（1H，d，=7.5 Hz，H-5），6.85（1H，d，=7.5 Hz，H-14），6.71（1H，d，=7.5 Hz，H-12），6.68（1H，s，H-16），3.69（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C158.5（C-2），157.3（C-15），144.9（C-3），137.6（C-4），135.7（C-9），134.7（C-11），129.5（C-13），128.6（C-7），125.8（C-5），121.9（C-6），119.9（C-10），119.7（C-12），116.0（C-16），115.1（C-8），115.0（C-14），59.5（3-OCH3）；ESIMS：m/z 268.1 [M + H]+。

化合物5為白色晶體，ESIMS：m/z 311.1 [M + H]+，結(jié)合化合物1H和13C NMR，推斷分子式為C17H14N2O4，不飽和度為12。1H-NMR中給出了8個芳香氫信號，1個連氧次甲基H4.07和1個氮甲基信號H3.19；13C-NMR中給出12個芳香碳信號包括1個連氧芳香碳信號，提示分子中存在2個苯環(huán)；另外還給出2個酰胺碳信號C168.6和168.4以及1個氮甲基碳信號C31.7。以上數(shù)據(jù)表明化合物5為dioxopiperazine類衍生物，經(jīng)過與文獻(xiàn)進(jìn)行比對，確定化合物5為（+）-cyclopenol[24]（圖1）。

化合物4為白色粉末，ESIMS：m/z 268.1 [M + H]+，結(jié)合氫譜和碳譜，推測其分子式為C16H13NO3。1H-NMR中H12.07和9.64處給出2個活潑氫信號，分別對應(yīng)酰胺氫和羥基氫；低場區(qū)給出8個芳香氫信號；H3.69信號提示分子中存在1個甲氧基。1C-NMR中C158.5和157.3證明了酰胺碳和連氧芳香碳的存在；C59.5證明了甲氧基的存在。化合物4與2十分相似，不同之處在于多了1個苯環(huán)上的羥基。經(jīng)過與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對，確定化合物4為3--methylviridicatol[23]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CD3OD）：H7.55（1H，m，H-8），7.15（3H，m，H-6，H-7，H-9），7.01（1H，t，=7.5 Hz，H-17），6.71（1H，d，=7.5 Hz，H-16），6.12（2H，m，H-14，H-18），5.48（1H，s，15-OH），4.07（1H，s，H-10），3.19（3H，s，H-19）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）：C168.6（C-2），168.4（C-5），158.4（C-15），136.4（C-11），134.0（C-8），133.5（C-13），132.2（C-6），130.2（C-17），128.0（C-12），126.1（C-7），122. 3（C-9），118.5（C-18），117.0（C-16），113.9（C-14），71.6（C-3），65.9（C-10），31.7（C-19）；ESIMS：m/z 311.1 [M + H]+。

化合物6為白色晶體，HRESIMS：m/z 311.1028 [M + H]+，分子式為C17H14N2O4，不飽和度為12。1H NMR中H7.52（1H，dt，=8.0，1.5 Hz），7.14（1H，d，=8.0 Hz），7.09（1H，dt，=8.0，1.0 Hz），7.01（1H，dd，=8.0，1.0 Hz）提示分子中存在1,2-二取代苯環(huán)；H6.97（1H，t，=8.0 Hz），6.66（1H，dd，=8.0，1.5 Hz），6.11（1H，m），6.00（1H，d，=8.0 Hz）提示分子中存在1,3-二取代苯環(huán)；13C NMR中給出2個酰胺碳信號C166.0和165.4，1個氮甲基信號即與氫譜對應(yīng)的芳香碳信號。以上數(shù)據(jù)與化合物5極為相似，且分子量相同，仔細(xì)與文獻(xiàn)比對其核磁數(shù)據(jù)，確定化合物6為（-）-cyclopenol[23]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H7.52（1H，dt，=8.0，1.5 Hz，H-8），7.14（1H，d，=8.0 Hz，H-9），7.09（1H，dt，=8.0，1.0 Hz，H-7），7.01（1H，dd，=8.0，1.0 Hz，H-6），6.97（1H，t，=8.0 Hz，H-17），6.66（1H，dd，=8.0，1.5 Hz，H-16），6.11（1H，m，H-14），6.00（1H，d，=8.0 Hz，H-18），4.23（1H，s，H-10），3.06（3H，s，H-19）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C166.0（C-2），165.4（C-5），156.9（C-15），135.1（C-11），132.4（C-8），132.3（C-13），130.5（C-6），128.9（C-17），126.5（C-12），124.3（C-7），121.1（C-9），117.0（C-18），115.7（C-16），112.8（C-14），70.1（C-3），63.8（C-10），30.9（C-19）；HRESIMS：m/z 311.1028 [M + H]+，333.0849 [M + Na]+。

化合物7為黃色粉末，結(jié)合其ESIMS、1H和13C NMR，判斷分子式為C19H25N3O4，不飽和度為9。1H NMR中H7.54（1H，s）給出1個NH信號，6.16（1H，d，=6.0 Hz，H-8），5.77（1H，s，H-11），5.49（1H，d，=6.0 Hz，H-9），給出3個芳香氫信號；H5.10給出1個連氮?dú)湫盘?；H3.69給出1個甲氧基氫信號；H1.13、1.11、0.98和0.84處給出4個甲基信號。13C-NMR給出2個酰胺碳信號C167.3和161.4，4個季碳信號，7個次甲基碳信號，1個亞甲基碳信號，1個甲氧基碳信號和4個甲基碳信號。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的versicoloid A極為相似，仔細(xì)對比核磁數(shù)據(jù)，確定化合物7為versicoloid A[23]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H7.54（1H，s，NH-2），6.16（1H，d，=6.0 Hz，H-8），5.77（1H，s，H-11），5.49（1H，d，=6.0 Hz，H-9），5.10（1H，d，=5.5 Hz，H-15），4.46（1H，s，H-3），3.69（3H，s，H-20），2.62（1H，m，H-16），2.26（1H，m，H-21），1.20（2H，m，H-17），1.13（3H，d，=7.5 Hz，H-19），1.11（3H，d，=7.0 Hz，H-23），0.98（3H，d，=7.0 Hz，H-22），0.84（3H，t，=7.0 Hz，H-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C167.3（C-1），161.4（C-13），159.6（C-6），156.8（C-10），152.9（C-4），144.3（C-8），115.5（C-9），109.3（C-12），94.8（C-11），60.6（C-15），59.2（C-3），55.1（C-20），36.9（C-16），32.4（C-21），23.0（C-17），20.0（C-22），17.8（C-23），15.8（C-19），12.0（C-18）；ESIMS：m/z 360.2 [M + H]+。

化合物8為白色粉末，根據(jù)HRESIMS數(shù)據(jù)，判斷分子式為C20H27N3O4。化合物8的核磁數(shù)據(jù)與7很相似，主要的區(qū)別在于2個化合物的1,2,4-三取代芳香環(huán)（8：C/HC/H-7，C/H-8，C/H-10，129.6/7.65， 125.1/7.38，106.4/7.657：C/H-8，C/H-9，C/H-11，144.3/6.16，115.5/5.49，94.8/5.77）。同時，化合物8中多了1個甲氧基信號C/HC/H-7，51.1/3.92。進(jìn)一步仔細(xì)分析其核磁數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)進(jìn)行比對，確定化合物8為chrysopiperazine C[25]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，CDCl3）：H7.65（2H，d，=9.0 Hz，H-7，H-10），7.38（1H，d，=9.0 Hz，H-8），6.99（1H，s，NH-2），5.23（1H，d，=9.0 Hz，H-14），3.92（3H，s，H-22），3.27（3H，s，H-23），2.96（1H，m，H-18），2.53（1H，m，H-15），1.27（1H，m，H-20b），1.23（3H，m，H-17），1.10（3H，d，= 7.0 Hz，H-19），1.04（1H，m，H-20a），0.95（6H，m，H-16，H-21）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）：C170.3（C-1），161.5（C-12），159.2（C-9），144.9（C-4），140.6（C-6），129.6（C-7），125.1（C-8），121.5（C-11），106.4（C-10），88.7（C-3），60.9（C-14），56.0（C-22），51.1（C-23），36.4（C-18），33.6（C-15），25.3（C-20），20.2（C-17），19.8（C-16），12.6（C-21），11.1（C-19）。HRESIMS：m/z 374.2078 [M + H]+，396.1897 [M + Na]+。

將發(fā)酵提取物進(jìn)行減壓硅膠柱層析，以乙酸乙酯-石油醚（0—100%）、甲醇-乙酸乙酯（0—100%）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，分為7個組分（Fr.1—Fr.7）。Fr.2（1.6 g）經(jīng)ODS反相硅膠柱層析梯度洗脫（甲醇-水，60%—100%），后經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1）得到Fr.2-1—Fr.2-5。Fr.2-5經(jīng)反相HPLC（70%乙腈-水加0.1%三氟乙酸，2 mL·min-1）純化制備后得到11（28.1 mg）和12（11.5 mg）。Fr.3（4.5 g）經(jīng)正相硅膠柱層析（乙酸乙酯-石油醚，5%—100%）分離，后經(jīng)過ODS反相硅膠柱層析梯度洗脫，流動相采用30%—100%甲醇-水，得到Fr.3-1—Fr.3-6。Fr.3-2經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1），得到6（236.3 mg）。Fr.3-4經(jīng)過與Fr.3-2相同的分離步驟后，得到1（38.1 mg）。Fr.3-5經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1），后經(jīng)過100﹕1二氯甲烷/甲醇正相硅膠柱層析純化，得到Fr.3-5-1—Fr.3-5-3。Fr.3-5-1經(jīng)HPLC（60%甲醇-水，2 mL·min-1）分離純化后得到7（46.7 mg）。Fr.3-5-2和Fr.3-5-3分別在二氯甲烷-甲醇=1/1溶液中重結(jié)晶，得到2（13.6 mg）和3（5.4 mg）。Fr.3-6經(jīng)過反復(fù)的正相硅膠柱層析，最后通過HPLC制備，流動相為75%甲醇-水，得到8（14.0 mg）。Fr.4（3.3 g）經(jīng)過30%—90%甲醇-水ODS反相硅膠柱梯度洗脫，后經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1）純化，得到Fr.4-1—Fr.4-4。Fr.4-2在二氯甲烷-甲醇混合液中重結(jié)晶，得到5（118.4 mg）。Fr.4-3經(jīng)過HPLC純化，流動相為45%甲醇-（水+0.1%三氟乙酸），得到4（5.1 mg）。Fr.4-3經(jīng)HPLC 50%甲醇-水制備，得到10（35.8 mg）。Fr.5（2.4 g）經(jīng)過ODS反相硅膠柱層析梯度洗脫（甲醇-水，30%—90%），然后通過Sephadex LH-20凝膠柱層析（二氯甲烷-甲醇，1/1）分離，最后經(jīng)反相HPLC（55%甲醇-水，2 mL·min-1）制備，得到9（48.0 mg）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H9.05（1H，d，=4.0 Hz，NH-2），8.10（1H，d，=8.0 Hz，H-10），7.83（1H，t，=7.5 Hz，H-8），7.72（1H，d，=8.0 Hz，H-7），7.52（1H，t，=7.0 Hz，H-9），7.39（1H，d，=7.5 Hz，H-27），7.27（2H，m，H-24，H-25），7.07（1H，dd，=7.0，4.5 Hz，H-26），5.57（1H，s，17-OH），5.24（2H，m，H-3，H-14），4.85（1H，s，H-18），4.07（1H，q，=6.5 Hz，H-20），3.05（1H，dd，=15.0，5.0 Hz，H-15b），2.40（1H，d，=15.0 Hz，H-15a），1.47（3H，d，=6.5 Hz，H-29）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C167.8（C-1），165.6（C-21），159.4（C-12），147.5（C-4），146.7（C-6），139.8（C-28），136.0（C-23），134.5（C-8），129.3（C-25，C-26），127.3（C-7），127.2（C-9），126.2（C-10），124.4（C-27），120.7（C-11），113.8（C-24），79.8（C-18），74.1（C-17），65.5（C-3），63.4（C-20），53.9（C-14），36.1（C-15a），14.8（C-29）；ESIMS：m/z 430.2 [M + H]+。

發(fā)酵結(jié)束后，用紗布將菌體和發(fā)酵液過濾分開，發(fā)酵液采用乙酸乙酯萃取兩遍，濃縮至干；菌體采用乙酸乙酯浸泡菌體一次，后采用二氯甲烷﹕甲醇=1﹕1浸泡一遍，濃縮后，將未干的溶液用乙酸乙酯萃取3遍，濃縮至干，與菌液提取物合并，得到發(fā)酵提取物26.8 g。

化合物10為橘紅色粉末，質(zhì)譜中在m/z 361.1處給出 [M + H]+分子離子峰，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C18H16O8，不飽和度為11。其HPLC吸收與TLC特征提示該10為蒽醌類化合物。1H-NMR中低場區(qū)給出3個芳香氫信號，高場區(qū)給出1個亞甲基、1個次甲基信號和1個甲基信號，同時給出2個連氧亞甲基信號。13C-NMR中給出2個羰基碳信號，12個芳香碳信號，2個連氧碳信號。以上數(shù)據(jù)經(jīng)過與文獻(xiàn)進(jìn)行比對，確定化合物10為versiconol[27]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.74（1H，s，1-OH），12.09（1H，s，8-OH），11.17（2H，s，3-OH，6-OH），7.14（1H，s，H-5），7.02（1H，s，H-4），6.50（1H，s，H-7），3.67（2H，m，H-1′），3.45（1H，m，H-2′），3.28（2H，m，H-4′），1.90（2H，s，H-3′）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C189.0（C-9），181.3（C-10），165.0（C-6），164.2（C-8），163.5（C-3），163.1（C-1），135.0（C-11），132.2（C-14），122.9（C-2），108.8（C-4），108.6（C-5，C-8a），108.2（C-9a），108.1（C-7），62.8（C-1′），60.1（C-4′），35.3（C-2′），32.6（C-3′）；ESIMS：m/z 361.1 [M + H]+。

(1)標(biāo)題序號：引言部分序號為0。正文標(biāo)題序號分別用阿拉伯?dāng)?shù)字依次編寫，如“1”“1.1”“1.1.1”,四級以下可用(1)，①等劃分層次。

化合物11為橘紅色粉末，通過HRESIMS：m/z 367.0819 [M - H]?，判斷分子式為C20H16O7，不飽和度為13。其HPLC吸收提示11與10為同系列蒽醌化合物，但不飽和度和碳個數(shù)均多了2。1H-和3C-NMR顯示2個化合物蒽醌骨架一致，區(qū)別僅在于11的分子中多了2個環(huán)結(jié)構(gòu)（C101.1（C-5′），66.1（C-1′），35.2（C-2′），27.4（C-4′），26.9（C-6′），15.4（C-3′）H5.15（H-1′），1.40—1.92（H-2′，3′，4′），1.50（H-6′））。仔細(xì)分析其核磁數(shù)據(jù)，確定化合物11為averufin[27]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.29（1H，s，1-OH），11.92（1H，s，8-OH），11.30（1H，s，6-OH），6.95（1H，s，H-5），6.83（1H，s，H-4），6.46（1H，s，H-7），5.15（1H，s，H-1′），1.40—1.92（6H，m，H-2′，3′，4′），1.50（3H，s，H-6′）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C188.6（C-9），180.5（C-10），165.2（C-8），164.2（C-1），159.8（C-6），158.1（C-3），134.6（C-4a），132.9（C-10a），115.9（C-2），108.9（C-5），108.4（C-9a），108.2（C-8a），107.9（C-7），107.1（C-4），101.1（C-5′），66.1（C-1′），35.2（C-2′），27.4（C-4′），26.9（C-6′），15.4（C-3′）。HRESIMS：m/z 367.0819 [M - H]?。

中藥學(xué)是研究中藥的基本理論和常用中藥的性能、功效與臨床應(yīng)用規(guī)律等知識的一門學(xué)科。中藥學(xué)在高等中醫(yī)藥院校課程體系中具有承前啟后的獨(dú)特作用和地位[1]，是學(xué)生由理論基礎(chǔ)邁向臨證實(shí)踐的橋梁課，其授課水平將對學(xué)生今后的從醫(yī)之路產(chǎn)生較為直接而深遠(yuǎn)的影響。中藥學(xué)體系完整、內(nèi)容豐富、縱貫古今，對主講教師而言是一個可以“大有作為”的重要平臺。筆者認(rèn)為，在著力提升中藥學(xué)教學(xué)質(zhì)量的問題上，授課教師應(yīng)盡全力打造精彩、非凡、卓越的中藥課堂，使學(xué)生收獲知識、思維、技能、文化等多方面、多層次的情感體驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)專業(yè)教育與德育的“雙豐收”，為進(jìn)一步提升教育教學(xué)水平提供有益的嘗試和探索。

化合物12為橘紅色粉末，通過高分辨質(zhì)譜，推斷其分子式為C20H18O7，不飽和度為12。仔細(xì)分析12的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其也是一個蒽醌類化合物，比10多了1個不飽和度，碳個數(shù)比10多了2個，提示10比12多了1個環(huán)結(jié)構(gòu)?；衔?2蒽醌骨架的核磁數(shù)據(jù)與10十分相似，不同之處在于兩個化合物的高場區(qū)。經(jīng)過與文獻(xiàn)進(jìn)行比對，確定化合物12為noraverufanin[28]（圖1）。

核磁波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR（500 MHz，DMSO-6）：H12.78（1H，s，1-OH），12.10（1H，s，8-OH），11.27（1H，s，6-OH），10.72（1H，s，3-OH），7.11（1H，s，H-5），7.09（1H，s，H-4），6.58（1H，s，H-7），4.96（1H，d，=14.0 Hz，H-1′），3.61（1H，m，H-5′），1.30—1.97（6H，m，H-2′，3′，4′），1.16（3H，d，=7.5 Hz，H-6′）；13C-NMR（125 MHz，DMSO-6）：C188.8（C-9），181.1（C-10），165.1（C-6），164.2（C-8），162.7（C-3），161.6（C-1），134.9（C-10a），133.3 （C-4a），120.0（C-2），108.8（C-5），108.7（C-9a），108.7（C-8a），108.4（C-4），108.1（C-7），74.6（C-1′），73.0（C-5′），32.4（C-2′），28.2（C-4′），23.4（C-3′），21.9（C-6′）。HRESIMS：m/z 369.0987 [M - H]?。

2.2 抗菌活性

對化合物1—12進(jìn)行抗燕麥?zhǔn)乘峋}卜軟腐歐文氏菌密執(zhí)安棒形桿菌丁香假單胞菌青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌活性測試，發(fā)現(xiàn)在初篩濃度為200和100 μg·mL-1濃度下，僅3,6--dimethylviridicatin（3）對青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌表現(xiàn)出了顯著的抗植物病原細(xì)菌活性。進(jìn)一步測試其MIC，化合物3對青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌的MIC分別為50和100 μg·mL-1（表1），陽性藥硫酸鏈霉素的MIC為25 μg·mL-1。3,6--dimethylviridicatin（3）對其余4種植物病原細(xì)菌沒有明顯的抑菌活性。

圖1 化合物1—12的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

3 討論

本研究從一株海洋雜色曲霉D5發(fā)酵提取物中分離鑒定了12個化合物，包括4個2-羰基-4-苯基喹啉生物堿（1—4）、2個雙氧代哌嗪生物堿（5—6）、3個喹唑啉fumiquinazolines生物堿及其衍生物（7—9）和3個蒽醌類化合物（10—12）。曲霉是重要的海洋真菌類群，在海洋真菌中占有很大比例，天然產(chǎn)物研究最多的海洋真菌是海洋曲霉。海洋曲霉源天然產(chǎn)物的研究始于1992年，NUMATA等[29]報(bào)道了首例海洋曲霉來源的新天然產(chǎn)物fumiquinazolines A-C，至2014年8月，已報(bào)道512個海洋曲霉來源的新天然產(chǎn)物。此后，越來越多的化合物從海洋曲霉中分離出來。2015—2018年，共報(bào)道了389個海洋曲霉來源新化合物，這不包括紅樹林來源的海洋曲霉，這些化合物結(jié)構(gòu)類型多樣，包括聚酮、生物堿、萜類、甾體、肽類等，且有多種生物活性，包括抗菌、細(xì)胞毒、抗氧化等[8,30-32]。本文所獲得的4種結(jié)構(gòu)類型化合物在海洋曲霉中均有過報(bào)道。

自然界中的2-羰基-4-苯基喹啉生物堿只由真菌產(chǎn)生，生源途徑是由鄰氨基苯甲酸衍生而來，目前發(fā)現(xiàn)的該類化合物大部分來自于青霉菌，亞熱帶、溫帶、寒帶環(huán)境的青霉中均發(fā)現(xiàn)了該類化合物的存在，其中也包括海洋青霉[33]。2-羰基-4-苯基喹啉生物堿的生物活性報(bào)道較少，多數(shù)研究沒有發(fā)現(xiàn)其明顯的生物活性，但該類化合物抗腫瘤活性顯著。Wei等[21]從一株紅樹來源的青霉sp.發(fā)酵提取物中分離鑒定了一個新的2-羰基-4-苯基喹啉生物堿viridicatol，通過核磁及單晶衍射確定了其結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)該化合物對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF7、人白血病細(xì)胞K56具有顯著的抑制活性，IC50在16.5—80.0 μg·mL-1；He等[34]從一株海水來源的楊奇青霉（）中獲得了4種化合物，測試了它們對8種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，其中3*,4*-dihydroxy-4-(4′-methoxyphenyl)- 3,4-dihydro-2(1)- quinolinone對人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3表現(xiàn)出了中等的毒性，quinolinonepeniprequinolone表現(xiàn)出了強(qiáng)的非選擇性細(xì)胞毒活性。也有研究報(bào)道了2-羰基-4-苯基喹啉生物堿對革蘭氏陽性菌中等的抑制活性，Pan等[35]從螃蟹來源的雜色曲霉XZ-4發(fā)酵物中分離鑒定出3,6-odimethylviridicatin和9-hydroxy-3- methoxyviridicatin，發(fā)現(xiàn)它們對大腸桿菌（）具有中等的抗菌活性，MIC為32 μg·mL-1。在本研究中所獲得的4個2-羰基-4-苯基喹啉生物堿中，只有3,6--dimethylviridicatin（3）表現(xiàn)了顯著的抗植物病原細(xì)菌活性。分析其結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，3與1、2、4結(jié)構(gòu)上的不同之處主要體現(xiàn)在C-6多了1個甲氧基，該甲氧基可能是化合物發(fā)揮抗植物病原細(xì)菌作用的關(guān)鍵基團(tuán)。同時，文獻(xiàn)中報(bào)道了9-hydroxy-3- methoxyviridicatin對大腸桿菌的抑菌作用，表明8-OH可能也是該類化合物發(fā)揮抗菌作用的重要基團(tuán)。

表1 化合物3對青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌抑菌數(shù)據(jù)

未加藥菌液OD600分別為0.4733（青枯雷爾氏菌）、1.1362（野油菜黃單胞菌）The OD600of un-treated bacteria solution is 0.4733 () and 1.1362 (), respectively；空白對照OD600分別為0.0711（青枯雷爾氏菌）、0.0763（野油菜黃單胞菌）The OD600of blank control is 0.0711 () and 0.0763 (), respectively?！啊保何礈y試No test喹唑啉fumiquinazolines生物堿是一類結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特的化合物，結(jié)構(gòu)特征為包含一個pyrazino [2,1-b] quinazoline-3,6-dione母核，并連接一個吲哚。自1992年首次發(fā)現(xiàn)以來，目前共發(fā)現(xiàn)了80多個該類化合物，主要由陸地和海洋真菌代謝產(chǎn)生，這類化合物及其前體具有十分顯著的生物活性，包括抗腫瘤、抗菌，尤其是在化療藥物方面具有顯著療效[36]。本研究獲得了一個喹唑啉fumiquinazolines生物堿（9）和兩個未連吲哚的喹唑啉生物堿（7、8），據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其中8和9的生物活性顯著，而并未發(fā)現(xiàn)7明顯的生物活性。Fremlin等[26]從澳大利亞海沙來源的雜色曲霉中分離獲得化合物9，通過核磁及Marfey反應(yīng)確定了它的結(jié)構(gòu)，活性測試發(fā)現(xiàn)了其抗菌作用；Wang等[23]從一株深海來源的雜色曲霉發(fā)酵液中獲得了化合物8和9，對幾種植物病原菌尖孢炭疽菌（）、稻瘟病菌（）和尖鐮孢（）表現(xiàn)出了顯著的抑菌活性，特別是化合物8對尖孢炭疽菌的抑制效果強(qiáng)于陽性藥放線菌酮。本研究發(fā)現(xiàn)，所獲得的喹唑啉fumiquinazoline生物堿及其衍生物均沒有抗植物病原細(xì)菌活性，該類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，新穎度高，且文獻(xiàn)報(bào)道了它們的抗植物病原真菌活性。因此，值得繼續(xù)挖掘該類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，從中發(fā)現(xiàn)抗真菌生物農(nóng)藥先導(dǎo)化合物。

4 結(jié)論

從一株海藻來源的雜色曲霉D5發(fā)酵培養(yǎng)基中分離鑒定了9個生物堿類化合物（1—9）和3個蒽醌類化合物（10—12）。其中，2-羰基-4-苯基喹啉生物堿3,6--dimethylviridicatin（3）對青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌等植物病原細(xì)菌具有顯著的抗菌活性，6-OCH3可能是該類化合物抗菌作用的關(guān)鍵基團(tuán)。

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Secondary Metabolites from a Marine-Derived Fungusand Their Anti-Phytopathogenic Bacterial Activity

FU Bing1,2, WANG Mei1, LIU JianYang2, LIN Wei2, ZHANG ChengSheng1, ZHAO DongLin1

(1Marine Agriculture Research Center, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong;2Nanping Branch, Fujian Tobacco Company, Nanping 353000, Fujian)

【Objective】Plant bacterial diseases are becoming more and more serious, and lack of control pesticides. The objective of this study is to isolate bioactive compounds from the previously obtained marine-derived fungusD5 with antibacterial activity and abundant secondary metabolites, identify their chemical structures, evaluate their anti-phytopathogenic bacterial activity, so that to clarify the antibacterial components of the target fungus. This research will provide lead compounds for the discovery of new antibacterial pesticides.【Method】The compounds were isolated by silica gel column chromatography (CC), octadecylsilyl silica gel CC, Sephadex LH-20 CC, and semipreparative HPLC, and were identified by modern spectral analysis methods including NMR and MS spectra. In addition, the actibacterial activity of the isolated compounds towards six phytopathogenic bacteria, including,,,,and, was evaluated by double dilution method to obtain the minimum inhibitory concentration (MIC).【Result】Twelve compounds were isolated and identified from the ethyl acetate extract of the marine-derived fungusD5 fermented by potato dextrose water media, including four 4-aryl-quinolin-2-one alkaloids, viridicatin (1), 3--methylviridicatin (2), 3,6--dimethylviridicatin (3), and 3--methylviridicatol (4), two dioxopiperazine alkaloids, (+)-cyclopenol (5) and (-)-cyclopenol (6), three fumiquinazolines alkaloids and their derivatives, versicoloid A (7), chrysopiperazine C (8), and cottoquinazoline A (9), and three anthraquinone derivatives, versiconol (10), averufin (11), and noraverufanin (12). Among them, a 4-aryl-quinolin-2-one alkaloid, 3,6--dimethylviridicatin (3) exhibited an obvious antibacterial activity againstandwith MIC values of 50 and 100 μg·mL-1, respectively. The structure activity relationship analysis revealed that the methoxy group at C-6 might play an important role in anti-phytopathogenic bacterial activity.【Conclusion】The metabolites ofD5 are abundant, which can produce alkaloids and anthraquinones with various structures. Among them, nine alkaloids and three anthraquinones were obtained from cultures of D5. 3,6--dimethylviridicatin (3) exhibited clear antibacterial activities towardsand.

marine-derived fungus;; alkaloid; anthraquinone; structural identification; phytopathogenic bacteria

2020-02-29；

2020-05-08

國家自然科學(xué)基金（41806194）、山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（SD2019ZZ002）、福建省農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目（201735070024072，201735000024112）

付兵，E-mail：fb1501@163.com。通信作者趙棟霖，E-mail：zhaodonglin@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）