原新博，程婷婷，惠小涵，陳章玉，王瑞紅，柯衛(wèi)東，郭宏波

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院/中藥指紋圖譜國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/陜西省中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物庫(kù)研究中心，陜西楊凌 712100；2西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，武漢430065）

0 引言

【研究意義】蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我國(guó)最大的水生蔬菜種類[1]，藥食兩用，其整個(gè)植株10個(gè)部位中有6個(gè)部位入藥，具有降脂減肥、抗氧化、抗衰老、安神助眠等藥理學(xué)功效。蓮藕具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用功效[2]，但采后褐變嚴(yán)重影響了其商品性及加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為解決蓮藕采后貯藏和加工過(guò)程中由多酚氧化酶（PPO）引起的褐變問(wèn)題，研究篩選、驗(yàn)證PPO與何蛋白互作，逐步摸清其在蓮藕中的作用機(jī)制，對(duì)于采后控制蓮藕褐變，延長(zhǎng)其產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PPO是由核基因編碼的一種含銅金屬酶[3]，可將其分為單酚氧化酶（酪氨酸氧化酶）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶）和漆酶 3類[4]，在動(dòng)植物、真菌和昆蟲(chóng)的質(zhì)體中廣泛存在[5-6]。PPO通常由3部分組成：一個(gè)N端導(dǎo)肽區(qū)，一個(gè)高度保守的CuA和CuB區(qū)以及一個(gè)C端疏水區(qū)域[7]；PPO的主要功能區(qū)是Cu結(jié)合區(qū)，其他部分對(duì)酶空間構(gòu)象、高級(jí)結(jié)構(gòu)形成和維持起作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)PPO在植物中有多種重要功能，如抗病蟲(chóng)害、抗機(jī)械損傷、參與花色的形成、參與光合作用、酶促褐變等[9-13]。在植物細(xì)胞中，PPO和多酚是相互獨(dú)立的兩類物質(zhì)，前者主要分布于類囊體中，后者存在于液泡中，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，PPO會(huì)在氧氣的參與下，催化多酚類物質(zhì)生產(chǎn)醌類黑色素，使蓮藕等果蔬褐變[7,14]。草酸處理蓮藕切片可延緩切面褐變，并且顯著降低PPO的活性[15]?？箟难岷吞J薈凝膠聯(lián)合使用抑制貯藏期間蓮藕表面褐變，并抑制過(guò)氧化物酶（POD）和PPO的活性[16]。通過(guò)人工microRNAs基因沉默技術(shù)，同時(shí)下調(diào)馬鈴薯多酚氧化酶基因家族中StuPPO2、StuPPO3和StuPPO4，會(huì)產(chǎn)生低活性的PPO和低褐變的馬鈴薯[17]。洋蔥提取物中的低分子量化合物對(duì)芋頭多酚氧化酶和酶促褐變具有抑制作用[18]。番木瓜粗提物中存在的低分子量熱穩(wěn)定陰離子化合物可與 PPO催化活性雙核位點(diǎn)結(jié)合，抑制PPO的活性[19]。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反義PPO轉(zhuǎn)入蘋(píng)果愈傷組織中，PPO活性和愈傷組織的褐變潛力均發(fā)生變化[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于PPO導(dǎo)致蓮藕等果蔬褐變的分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道，僅有關(guān)于酶學(xué)性質(zhì)、體外抑制PPO活性、生理活性等的研究。有研究表明SOD、CAT和POD等抗氧化酶也參與了蓮藕的褐變過(guò)程[21]。筆者課題組前期發(fā)現(xiàn)NnPPO1與多個(gè)蛋白存在互作[22]，本研究進(jìn)一步篩選、驗(yàn)證與蓮藕NnPPO1互作的褐變相關(guān)酶。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用Y2H技術(shù)，從抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)中篩選出NnCAT1與NnPPO1存在蛋白互作；利用BiFC技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證NnPPO1與NnCAT1之間是否存在互作，通過(guò)截短蛋白尋找互作關(guān)鍵位點(diǎn)；并對(duì)NnPPO1與NnCAT1進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析；對(duì)NnCAT1進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位分析。為深入研究蓮藕中NnPPO1與NnCAT1互作的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為精準(zhǔn)控制NnPPO1酶活性、降低褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為蓮藕‘鄂蓮5號(hào)’品種；煙草為本氏煙草（Nicotiana benthamiana），種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中，萌發(fā)后7 d左右開(kāi)始澆營(yíng)養(yǎng)液，每隔2 d澆一次，溫室溫度為25℃，濕度約為70%，光照周期為14 h光照、10 h黑暗。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及載體 植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；大腸桿菌感受態(tài)、酵母菌感受態(tài)、農(nóng)桿菌感受態(tài)、同源重組試劑盒Quick-Clone Mix購(gòu)自陜西普因特生物公司；DNA marker、DNA膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；X-α-Gal、Aureobasidin A購(gòu)自Clontech公司；PCR引物合成及載體測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

構(gòu)建所有載體使用的大腸桿菌是EPI300感受態(tài)，酵母雙雜試驗(yàn)所用載體為pGADT7和pGBKT7，酵母菌株為Y2HGold感受態(tài)，亞細(xì)胞定位試驗(yàn)使用的載體是p35S-eGFP[23]，雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)所使用的載體是35S-SPYNER173與35S-SPYCEM[24]。注射煙草葉片所使用的農(nóng)桿菌菌株是GV3101感受態(tài)。

1.2 RNA提取及基因克隆

使用Plant RNA Extraction Kit（Takara）提取蓮藕葉片總RNA；利用PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以蓮藕葉片cDNA為模板，利用基因特異性引物（表1）對(duì)抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）（GenBank: GU174022）[25]、過(guò)氧化氫酶（NnCAT1）、胞質(zhì)銅-鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）（GenBank: GQ149102）[26]、半胱氨酸過(guò)氧化物酶（PER1）（GenBank: KU923323）[27]、過(guò)氧化物酶3（POD3L）（GenBank: XM_010245037）、過(guò)氧化物酶 43（POD43L）（GenBank: XM_010247537）、過(guò)氧化物酶 P7（PODP7L）（GenBank: XM_010248161）等5種抗氧化酶的7個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系為 25 μL：cDNA 1 μL、PrimeSTAR Max Premix（2×）12.5 μL、上下游引物各 1 μL 和 ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 10 s；60℃ 15 s，72℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)，16℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用膠回收試劑盒純化，得到目的片段。

1.3 共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證

按照同源重組Quick-Clone Mix試劑盒的操作步驟，將APX、NnCAT1、CuZnSOD、PER1、POD3L、PODP7L、POD43L等的編碼區(qū)分別克隆到 pGADT7（AD）載體上，課題組前期構(gòu)建多酚氧化酶誘餌載體NnPPO1-BD和去除N端導(dǎo)肽部分的誘餌載體JDPPO1-BD[22]；通過(guò)PEG/LiAc介導(dǎo)的方法，將質(zhì)粒組合APX-AD+JDPPO1-BD、NnCAT1-AD+JDPPO1-BD、CuZnSOD-AD+JDPPO1-BD、PER1-AD+JDPPO1-BD、POD3L-AD+JDPPO1-BD、POD43L-AD+JDPPO1-BD、PODP7L-AD+JDPPO1-BD、pGBKT7-53+pGADT7-T（陽(yáng)性對(duì)照）和pGBKT7-Lam+pGADT7-T（陰性對(duì)照）分別轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于DDO（SD/-Trp/-Leu）二缺平板上，進(jìn)行篩選含質(zhì)粒的酵母，28℃培養(yǎng)3—5 d。從DDO平板上挑取直徑為2—3 mm的陽(yáng)性克隆于DDO液體培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（12—16 h）。吸取1.5 μL酵母菌液均勻點(diǎn)播于提前標(biāo)記好的QDO（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）/X-α-Gal/AbA 和 DDO（SD/-His/-Ade）培養(yǎng)基上，28—30℃生長(zhǎng)3—5 d后，分析菌落的生長(zhǎng)狀況。

1.4 互作蛋白的毒性和自激活檢測(cè)

前期已做過(guò)NnPPO1的毒性與自激活檢測(cè)[22]，利用基因特異性引物將NnCAT1的編碼區(qū)克隆至pGBKT7（BD）載體上，將重組載體NnCAT1-BD和

空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于SD/-Trp培養(yǎng)基上篩選，挑取單克隆，稀釋100倍分別涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上。將質(zhì)粒組合 NnCAT1-BD+AD、pGBKT7-53+pGADT7-T（陽(yáng)性對(duì)照）、pGBKT7-53+pGADT7-Lam（陰性對(duì)照）分別轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂于DDO（SD/-Trp/-Leu）二缺平板上，挑菌后均勻點(diǎn)播于SD/-Trp和SD/-Trp/-Leu/-His培養(yǎng)基上，28—30℃生長(zhǎng)3—5 d后，分析菌落的生長(zhǎng)狀況。

表1 PCR 引物列表Table 1 PCR primer list

1.5 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證互作蛋白

利用同源重組技術(shù)，選擇BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)，將NnPPO1和NnCAT1的編碼區(qū)分別構(gòu)建至35S-SPYNER173和35S-SPYCEM載體上，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，28℃生長(zhǎng)2 d后挑取陽(yáng)性菌落于YEB液體培養(yǎng)基（含20 μg·mL-1Rif和50 μg·mL-1Kana）中，28℃振蕩培養(yǎng) 12—16 h。離心收集菌體，用煙草注射滲透液（10 mmol·L-1MES-KOH（pH 5.6）、10 mmol·L-1MgCl2和 150 μmol·L-1乙酰丁香酮）重懸菌體至 OD600=0.8，將含有 35S-NnPPO1-SPYNER173、35S-NnCAT1-SPYCEM、P19和 35SNnPPO1-SPYNER173、35S-SPYCEM、P19的菌液分別按照1∶1∶1混合后黑暗靜止4 h，然后注射到生長(zhǎng)約35 d的煙草葉片中。2—5 d內(nèi)，使用生物激光共聚焦顯微鏡（LECIA TCSSP8）觀察表皮細(xì)胞的黃色熒光信號(hào)。

經(jīng)濟(jì)發(fā)展形勢(shì)好，但國(guó)防觀念不牢固。經(jīng)濟(jì)功能區(qū)是各地經(jīng)濟(jì)發(fā)展的火車頭，總體發(fā)展形勢(shì)比較好，但專注考慮經(jīng)濟(jì)發(fā)展多，對(duì)包括武裝工作在內(nèi)的其他工作大多重視不夠。有的黨政機(jī)關(guān)對(duì)民兵工作認(rèn)識(shí)不全面不深入，一些企業(yè)認(rèn)為編民兵會(huì)影響生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)，有的甚至害怕與軍方有關(guān)聯(lián)影響對(duì)外貿(mào)易；同時(shí)受長(zhǎng)期和平環(huán)境影響，全民國(guó)防意識(shí)有所淡化，企業(yè)員工對(duì)加入民兵組織積極性不高，民兵訓(xùn)練難落實(shí)的問(wèn)題在經(jīng)濟(jì)功能區(qū)也更為突出。

1.6 蛋白序列分析和互作結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)兩種方法證實(shí)NnPPO1和NnCAT1之間是否存在互作及兩者間如何互作，對(duì)NnPPO1和NnCAT1序列進(jìn)行分析，用NCBI的Conserved Domains服務(wù)器分析NnPPO1和NnCAT1蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；使用DNAMAN軟件對(duì)NnCAT1與其他物種CAT序列進(jìn)行多序列比對(duì)；根據(jù)NnPPO1和NnCAT1的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，將 NnCAT1的主要結(jié)構(gòu)域 Catalase Domain（16—398 aa）和 Heme-binding Enzyme Domain（16—493 aa）分別構(gòu)建到 AD載體上，將 NnPPO1的主要結(jié)構(gòu)域 Tyrosinase Domain（175—380 aa）、PPO1_KFDV Domain（381—468 aa）和 PPO1_DWL Domain（469—597 aa）分別構(gòu)建到BD載體上，利用酵母雙雜的技術(shù)分析互作關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。

1.7 亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)引物（表1），使用PrimeSTAR擴(kuò)增出NnCAT1的編碼區(qū)，選擇BamH I和KpnI酶切位點(diǎn)，然后構(gòu)建到p35S-eGFP載體上，與GFP蛋白融合表達(dá)。通過(guò)農(nóng)桿菌注射本氏煙草。2—5 d，在生物激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光以及紅色熒光信號(hào)。

1.8 NnPPO1與NnCAT1的組織特異性表達(dá)

啟動(dòng)子不僅調(diào)控著基因的表達(dá)水平，也調(diào)控著基因表達(dá)的時(shí)空順序。用 PlantCARE對(duì)NnPPO1和NnCAT1的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析；然后對(duì)它們的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析，先將鄂蓮5號(hào)的蓮子在試驗(yàn)室發(fā)芽，待芽長(zhǎng)至約10 cm時(shí)，選取大小基本一致的蓮藕幼苗，種植于塑料桶中，桶內(nèi)裝土高度約10 cm，桶內(nèi)裝滿水。待蓮藕葉片完全展開(kāi)，并長(zhǎng)出藕帶時(shí)，采收葉、葉柄、根、藕帶、莖尖等部位，用液氮速凍，放于-80℃冰箱儲(chǔ)存。使用RNA提取試劑盒提取樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，蓮藕β-actin為內(nèi)部參照基因[28]，在QuantStudio（TM）6 Flex System實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各 0.8 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，稀釋5倍的cDNA 2 μL，以ddH2O補(bǔ)足至20 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，30 s；95℃，10 s，60℃，30 s，72℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，4 min。并通過(guò)SPSS的t檢驗(yàn)確定顯著性（P≤0.05）[29]。各部位樣品均設(shè)3個(gè)技術(shù)性和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.9 NnCAT1的生物信息學(xué)分析

為進(jìn)一步探討NnCAT1的生物學(xué)功能及其在蓮藕褐變中的作用機(jī)制，本研究使用 Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì) NnCAT1蛋白（XP_010242894）的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用 TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)NnCAT1的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/）對(duì) NnCAT1的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用 ChloroP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）對(duì)NnCAT1的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用 Expasy（https://web.expasy.org/protscale/、https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蓮藕NnCAT1的親疏水性分析；為了研究NnCAT1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，分別用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）[30]預(yù)測(cè) NnCAT1二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選NnPPO1的互作蛋白

以蓮藕cDNA為模板擴(kuò)增7個(gè)基因（APX、CuZnSOD、PER1、POD3L、POD43L、PODP7L和NnCAT1）的編碼區(qū)，分別得到1 044、459、660、981、963、957和1 479 bp的條帶（圖1-A）。將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至EPI300大腸桿菌后，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)分析，得到的條帶與預(yù)期的目的片段大小相同，將陽(yáng)性菌液測(cè)序比對(duì)成功后，進(jìn)行Y2H配對(duì)分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母菌在 DDO平板上生長(zhǎng)良好，只有含NnCAT1-AD+JDPPO1-BD的酵母菌和陽(yáng)性對(duì)照能在QDO/X/A平板上生長(zhǎng)（圖 1-B），表明 JDPPO1與NnCAT1之間可能存在蛋白互作。

2.2 互作蛋白的毒性和自激活檢測(cè)

本研究對(duì)NnCAT1進(jìn)行自激活和毒性檢測(cè)。將含有NnCAT1-pGBKT7和對(duì)照組空載體pGBKT7的酵母，稀釋相同倍數(shù)后分別涂布在 SD/-Trp平板上，結(jié)果顯示，兩個(gè)平板上的菌落大小和數(shù)目基本相同（圖2-A），表明重組載體表達(dá)的NnCAT1蛋白對(duì)酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，對(duì)酵母菌無(wú)毒性。將含有NnCAT1-pGBKT7、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的酵母菌，稀釋相同倍數(shù)后分別涂布在一缺 SD/-Trp和三缺SD/-Trp/-Ade/-His平板上，只有陽(yáng)性對(duì)照在一缺和三缺平板上正常生長(zhǎng)，含NnCAT1-pGBKT7載體的酵母菌和陰性對(duì)照在三缺平板上不能生長(zhǎng)（圖 2-B），說(shuō)明 NnCAT1無(wú)自激活作用，無(wú)法將報(bào)告基因激活，JDPPO1與NnCAT1在酵母系統(tǒng)中確實(shí)存在互作。

圖1 基因的克隆及互作蛋白篩選Fig. 1 Gene cloning and screening of interacting proteins

圖2 蓮藕NnCAT1蛋白的毒性和自激活檢測(cè)Fig. 2 Detection of Toxicity and self-activation of NnCAT1 Protein

2.3 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證蛋白互作的真實(shí)性

35S-NnPPO1-SPYNER173與35S-NnCAT1-SPYCEM的組合有很強(qiáng)的黃色熒光信號(hào)，并且黃色熒光主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，而35S-NnPPO1-SPYNER173與空載體 35S-SPYCEM 的組合中未觀察到黃色熒光信號(hào)（圖3），說(shuō)明在BiFC系統(tǒng)中NnPPO1與NnCAT1存在蛋白互作，并且互作位置在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，也進(jìn)一步證實(shí)了酵母雙雜交結(jié)果。

圖3 雙分子熒光互補(bǔ)檢測(cè)NnPPO1與NnCAT1互作Fig. 3 Interaction between NnPPO1 and NnCAT1 detected by bimolecular fluorescence complementarity

2.4 蛋白序列分析和互作結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN軟件將NnCAT1與其他物種CAT氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白C末端包含保守的三肽模體（QKL）（圖4），該模體可以與PTS1受體結(jié)合，說(shuō)明蓮藕NnCAT1可能是通過(guò)PTS1系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶體。NnCAT1氨基酸序列與冬棗ZjCAT的相似度最高，達(dá)到91.67%，其次是與油菜、擬南芥、玉米、高粱的相似度分別為87.40%、86.79%、86.18%和86.18%，與大麥、木薯的相似度分別為83.94%和80.49%；證明該序列為蓮藕的CAT，故命名為 NnCAT1。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，NnPPO1主要有 Tyrosinase Domain（175—380 aa）、PPO1_DWL Domain（381—468 aa）和 PPO1_KFDV Domain（469—597 aa）等3個(gè)結(jié)構(gòu)域；NnCAT1主要有Catalase Domain（16—398 aa）和Heme-binding Enzyme Domain（16—493 aa）結(jié)構(gòu)域。將NnPPO1和NnCAT1的主要結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建到BD和AD載體上，BD-NnPPO1175-380、BD-NnPPO1381-468、BD-NnPPO1469-597分別與AD-NnCAT1互作的結(jié)果顯示，只有BD- NnPPO1175-380與AD-NnCAT1發(fā)生蛋白互作（圖5），說(shuō)明NnPPO1與NnCAT1的互作關(guān)鍵部位在其保守的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域（Tyrosinase domain）；而 AD-NnCAT116-398、AD-NnCAT116-493與BD-JDPPO1均不發(fā)生蛋白互作，在酵母系統(tǒng)中NnCAT1必須具有完整的氨基酸序列才可以與JDPPO1的互作。

圖4 蓮藕NnCAT1與其他物種CAT蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig. 4 Amino acid sequence alignment of NnCAT1 with other CAT proteins

圖5 酵母雙雜交驗(yàn)證互作關(guān)系Fig. 5 Results of the yeast two-hybrid

2.5 NnCAT1的亞細(xì)胞定位

將NnCAT1編碼區(qū)構(gòu)建至p35S-eGFP載體上，與載體中的eGFP蛋白融合表達(dá)，將重組質(zhì)粒與空載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過(guò)在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá) NnCAT1與 GFP的融合蛋白，發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)存在于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，并且與膜核定位信號(hào)（mCherry）紅色熒光重合，空載體 GFP顯示了相同的定位情況（圖6）。

圖6 NnCAT1蛋白的亞細(xì)胞定位分析Fig. 6 Subcellular localization analysis of NnCAT1 protein

2.6 NnPPO1與NnCAT1的組織特異性表達(dá)

利用PlantCARE對(duì)NnPPO1和NnCAT1起始密碼子上游約2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，NnPPO1序列中含有 AAAC-motif、Box 4、GT1-motif、TCCC-motif、TCT-motif、chs-CMA1a等光響應(yīng)元件，ARE逆境響應(yīng)元件，以及 CGTCA-motif、TGACG-motif、P-box等激素響應(yīng)元件，推測(cè)NnPPO1的表達(dá)可能受到上述各因素的調(diào)控。NnCAT1序列中含有ATCT-motif、Box 4、G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box、TCT-motif等光響應(yīng)性元件，ARE、MBS、TC-rich repeats等逆境響應(yīng)元件，以及ABRE、CGTCA-motif、TCA-element、TGACG-motif等激素響應(yīng)元件，推測(cè)NnCAT1的表達(dá)可能受到上述各因素的調(diào)控，部分響應(yīng)元件見(jiàn)表2。

表2 NnPPO1與NnCAT1啟動(dòng)子響應(yīng)元件Table 2 The response elements of NnPPO1 and NnCAT1

在蓮藕幼苗的不同組織中兩個(gè)基因均有表達(dá)。以葉中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，NnPPO1在葉中表達(dá)水平最高，根中其次，在莖尖中最低，并且NnPPO1在葉中的表達(dá)量是莖尖中的 15.19倍；NnCAT1在葉中表達(dá)水平最高，然后依次是葉柄、根、藕帶，在莖尖中的表達(dá)量最低。另外，NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)模式基本相同，都在葉中有最高的表達(dá)量，在莖尖中表達(dá)量最低。方差分析結(jié)果表明，5個(gè)部位中的NnPPO1表達(dá)量均有顯著差異；根中NnCAT1的表達(dá)量與藕帶中的差異不顯著，其余部位之間均差異顯著（圖7）。由此推測(cè)NnPPO1與NnCAT1可能在葉、葉柄和根的顏色與生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

2.7 NnCAT1的生物信息學(xué)分析

蓮藕NnCAT1的相對(duì)分子質(zhì)量約為57.0 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為6.93。正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為60個(gè)，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為62個(gè)，其分子式可寫(xiě)為 C2573H3874N716O727S17，不穩(wěn)定系數(shù)為33.03，屬于穩(wěn)定蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示NnCAT1無(wú)跨膜區(qū)、無(wú)信號(hào)肽；葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NnCAT1存在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，前21 aa為轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域。NnCAT1的親疏水性分析，結(jié)果如圖8所示，分值在0以上為疏水性氨基酸，在0以下為親水性氨基酸，得分最大值為2.389，最小值為-2.678，平均值為-0.587，證明NnCAT1是親水性蛋白質(zhì)。

圖7 NnPPO1與NnCAT1的組織特異性表達(dá)Fig. 7 Tissue-specific expression of NnPPO1 and NnCAT1

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NnCAT1蛋白由27.64%α-螺旋、15.65%延長(zhǎng)鏈、6.30%β-轉(zhuǎn)角和50.41%無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖9-A）。NnCAT1的三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其序列的一致性為47.64%，為同源四聚體蛋白，序列與模板序列的相似度為0.43，覆蓋為0.99，為Catalase-like Superfamily家族CATALASE蛋白，與目標(biāo)基因相吻合（圖9-B）。

圖8 NnCAT1蛋白親疏水性分析Fig. 8 Hydrophilicity of NnCAT1 Protein

圖9 NnCAT1的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 9 Secondary structure and tertiary structure prediction of NnCAT1

3 討論

3.1 NnPPO1與NnCAT1存在蛋白互作

蛋白互作是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，但關(guān)于PPO的蛋白互作，除本課題組研究結(jié)果外，未見(jiàn)其他文獻(xiàn)報(bào)道。張海星[31]通過(guò)酵母雙雜和BIFC證實(shí)了丹參PPO和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶存在互作關(guān)系，證明丹參PPO對(duì)丹酚酸類的代謝有一定的調(diào)控作用。擬南芥 AtNCA1與AtCAT2相互作用，可以將過(guò)氧化氫酶的折疊保持在功能狀態(tài)，AtNCA1對(duì)于過(guò)氧化氫酶活性至關(guān)重要[32]。水稻葉片中GLO和OsCAT的互作-解離是調(diào)節(jié)水稻中H2O2水平的一種特定機(jī)制[33]。

SOD和CAT酶活性是蓮藕褐變的第二主因子，所以在研究蓮藕褐變機(jī)理時(shí)，可以從SOD和CAT方面著手[21]。為了深入探索PPO導(dǎo)致蓮藕等果蔬褐變的分子機(jī)制，本研究利用蓮藕NnPPO1成員，通過(guò)酵母雙雜方法，從抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)中篩選出NnCAT1蛋白與NnPPO1互作，NnCAT1具有CAT蛋白家族的所有主要特征氨基酸殘基、基序和元件[34]，主要功能是催化過(guò)氧化氫分解為H2O和 O2，以防止活性氧自由基對(duì)植物造成的傷害[35]。同時(shí)過(guò)氧化氫酶在植物中有很多作用，如抗高（低）溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、抗病性、延緩植物衰老等[36-41]。本研究在煙草葉片細(xì)胞膜和細(xì)胞核上檢測(cè)到強(qiáng)烈的黃色熒光信號(hào)，更加確定了NnPPO1與NnCAT1之間存在相互作用關(guān)系。推測(cè) NnPPO1與 NnCAT1協(xié)同互作導(dǎo)致果蔬褐變，NnCAT1將H2O2分解產(chǎn)生的O2進(jìn)入質(zhì)體中，此時(shí)在NnPPO1的強(qiáng)烈催化下，產(chǎn)生的O2直接與多酚類物質(zhì)反應(yīng)形成醌類，這時(shí)果肉逐漸變色，具體還需要蛋白水平和遺傳水平的進(jìn)一步驗(yàn)證。

多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)NnCAT1與其他物種的CAT具有很高的相似度，表明不同物種間CAT序列具有很強(qiáng)的保守性；NnPPO1與NnCAT1的互作關(guān)鍵部位在其保守的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域，而此結(jié)構(gòu)域包含CuA和CuB的活性中心，互作結(jié)果與前人所述的 Tyrosinase Domain是NnPPO1主要功能區(qū)一致[8]；NnCAT1的完整氨基酸序列才能與JDPPO1發(fā)生互作，說(shuō)明除結(jié)構(gòu)域以外的部分對(duì)NnCAT1的互作過(guò)程中有不可或缺的作用，為進(jìn)一步研究互作機(jī)理及構(gòu)建cat1、ppo1突變體植株提供了參考。

3.2 亞細(xì)胞定位與組織表達(dá)特異性分析

本研究結(jié)果表明，NnCAT1定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核，而前期研究表明NnPPO1存在于葉綠體上[22]，結(jié)合它們的互作位置在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，說(shuō)明正常狀態(tài)時(shí)NnCAT1與NnPPO1并不接觸，推測(cè)在蓮藕組織或細(xì)胞受到損傷，這種空間隔離打破后，它們會(huì)到共同的位置上協(xié)同作用導(dǎo)致蓮藕褐變。研究表明 CAT定位于過(guò)氧化物酶體中，但也有分布于其他部位，玉米的CAT3定位于線粒體中，它可能在替代氧化酶途徑中起作用[42]。擬南芥 AtCAT3亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，AtCAT3定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體中，說(shuō)明AtCAT3也參與了細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中H2O2的代謝[43]。檳榔過(guò)氧化氫酶（ArCAT）亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，ArCAT1蛋白定位于過(guò)氧化物酶體中，而ArCAT2和 ArCAT3定位于過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞核中[44]。紅莧菜過(guò)氧化氫酶-酚氧化酶（AcCATPO）位于過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞核中[45]。CAT的定位與其在細(xì)胞中的功能有著密切的關(guān)系。

NnPPO1啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了很多光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)和激素響應(yīng)元件，NnCAT1啟動(dòng)子序列中發(fā)現(xiàn)了很多光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)、激素響應(yīng)、干旱響應(yīng)和參與防御和應(yīng)激反應(yīng)元件，推測(cè)其可能參與了植物體內(nèi)各種逆境脅迫應(yīng)答，為深入揭示蓮藕NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)[46]。組織特異性結(jié)果表明NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)模式基本相同，暗示NnCAT1與NnPPO1協(xié)同互作使蓮藕等果蔬褐變，推測(cè) NnPPO1與 NnCAT1在植物中可能具有廣譜的互作關(guān)系，以發(fā)揮更多的作用。蓮藕中含有大量的多酚氧化酶，因此，蓮藕是研究多酚氧化酶比較理想的植物材料。本研究結(jié)果為深入探討蓮藕NnPPO1與NnCAT1的生物學(xué)功能，研究蓮藕PPO的分子作用機(jī)制，精準(zhǔn)抑制其活性奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，從抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)中篩選出NnCAT1與NnPPO1存在蛋白互作；利用BiFC進(jìn)一步證實(shí)NnPPO1與NnCAT1之間的互作關(guān)系，且NnPPO1保守的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域在互作中發(fā)揮主要作用；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，NnCAT1蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上；組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示NnPPO1與NnCAT1的表達(dá)模式基本相同，都在葉中有最高的表達(dá)量，在莖尖中表達(dá)量最低。