趙煥之，趙其平，朱順海，王 璐，劉桂玲,2，李志行,2，董 輝，黃 兵，韓紅玉

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）是鈣離子信號(hào)通路中下游效應(yīng)分子中的一類，由Hetherington等于1987年在大豆中首次發(fā)現(xiàn)，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要分布于植物、綠藻和一些原生生物中，目前在細(xì)菌、真菌、酵母、線蟲和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)[1-3]。CDPKs由可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)四部分組成，其中調(diào)控區(qū)為鈣離子結(jié)合區(qū)，連接區(qū)與調(diào)控區(qū)共同構(gòu)成了該酶的活性域，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)，Ca2+與調(diào)控區(qū)結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象改變，從而發(fā)揮效應(yīng)[4-5]。

免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)是一種用于篩選互作蛋白的有效方法，已廣泛應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域。Phee等[6]用該技術(shù)鑒定了擬南芥中的光敏色素相互作用蛋白的潛在互作蛋白，并發(fā)現(xiàn)共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析是鑒定新的相互作用蛋白和確定細(xì)胞內(nèi)蛋白-蛋白質(zhì)相互作用的有效方法。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)ree等[7]應(yīng)用該技術(shù)尋找與神經(jīng)受體相互作用的蛋白質(zhì)。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt是細(xì)胞存活的關(guān)鍵蛋白，與多種蛋白質(zhì)相互作用，Huang等[8]利用該技術(shù)鑒定出了2個(gè)潛在的與Akt存在相互作用的蛋白。國內(nèi)研究人員利用該方法篩選獲得了6個(gè)可能與羊親環(huán)蛋白（cyclophilin B，CypB）相互作用的羊傳染性膿皰病毒相關(guān)蛋白、10個(gè)綿羊α-生育酚（α-TTP）轉(zhuǎn)移蛋白的潛在互作蛋白[9-10]。此外，與人類睪丸高遷移率蛋白4（high mobility group protein B4，HMGB4）相互作用的蛋白及與A型人流感病毒M2蛋白相互作用蛋白也是用該方法篩選獲得的[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn)，頂復(fù)門原蟲CDPKs控制著蟲體許多至關(guān)重要的Ca2+依賴的生理過程，包括微線體的分泌、細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)和運(yùn)動(dòng)復(fù)合體的調(diào)控等，從而影響蟲體的滑移運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞入侵和逃逸、發(fā)育階段的轉(zhuǎn)化、分化繁殖等[13-14]。比如：瘧原蟲CDPK3與其穿透按蚊小腸上皮細(xì)胞屏障有關(guān)[15]；弓形蟲CDPK3與蟲體移行有關(guān)，Gaji等[16]發(fā)現(xiàn)TgCDPK3可以通過磷酸化肌球蛋白馬達(dá)使蟲體逸出宿主細(xì)胞更加容易；韓紅玉等[17]發(fā)現(xiàn)了柔嫩艾美爾球蟲EtCDPK3與蟲體入侵宿主細(xì)胞有關(guān)，王自文等[18]對(duì)柔嫩艾美耳球蟲CDPK4進(jìn)行了特性分析，發(fā)現(xiàn)EtCDPK4是一種完全依賴于Ca2+的蛋白激酶，且抗重組蛋白rEtCDPK4多克隆抗體對(duì)球蟲子孢子入侵DF-1細(xì)胞的抑制率可達(dá)52%；呂凌等[19]篩選并驗(yàn)證了與EtCDPK4相互作用的柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸蛋白酶抑制蛋白（EtSerpin）。

蛋白質(zhì)通過與一個(gè)或多個(gè)蛋白相互作用來執(zhí)行許多的細(xì)胞功能。EtCDPK3是一種絲/蘇氨酸激酶，其所接收的胞外信號(hào)必定傳遞給下游的效應(yīng)分子，與下游作用底物的相互作用是其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。因此，本研究以柔嫩艾美耳球蟲子孢子為試驗(yàn)材料，利用免疫共沉淀技術(shù)篩選與EtCDPK3互作的蛋白，并結(jié)合質(zhì)譜定性鑒定分析，初步篩選出6個(gè)可能與EtCDPK3相互作用的蟲體相關(guān)蛋白，本研究結(jié)果為EtCDPK3在鈣離子信號(hào)通路中的功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲株與試劑E.tenella孢子化卵囊上海株（資源編號(hào)：CAAS21111601，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病團(tuán)隊(duì)保存）；EtCDPK3單克隆抗體與多克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存；免疫共沉淀試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；銀染試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 蟲體總蛋白的提取取純化好的儲(chǔ)存在液氮中的柔嫩艾美耳球蟲子孢子，PBS洗3遍，然后加入200 μL RIPA強(qiáng)裂解液重懸沉淀，再加入2 μL蛋白酶抑制劑和適量的玻璃珠，在渦旋振蕩器上間或振蕩。振蕩2 min，冰上放置30 s，反復(fù)振蕩45 min。然后12 000×g，4℃離心2 min，吸取上清液即為蟲體總蛋白。取20 μL進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色、脫色。剩下的蟲體蛋白保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫共沉淀篩選步驟參照Pierce?Co-Immunoprecipitation Kit操作說明書進(jìn)行。分別設(shè)置單克隆抗體樣品組（Mb）和多克隆抗體樣品組（Pb）及兩個(gè)陰性對(duì)照組（Mb-N，Pb-N），采用試劑盒中推薦的未被激活的耦合樹脂作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照組全部操作過程與正常試驗(yàn)耦合樹脂組一致?？贵w固定：加50 μL樹脂于離心柱，1000×g，離心1 min；用交聯(lián)緩沖液洗滌樹脂2次；加稀釋好的抗體，室溫旋轉(zhuǎn)孵育120 min；離心，用交聯(lián)緩沖液洗滌2次；加入含有氰基硼化鈉的淬滅緩沖液，室溫旋轉(zhuǎn)混勻15 min；用交聯(lián)緩沖液洗滌1次，洗滌緩沖液洗滌6次。捕獲目的蛋白：用裂解緩沖液洗滌樹脂2次；加入稀釋好的蟲體蛋白，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜；離心，并用裂解緩沖液洗滌3次。洗脫：將離心柱置于新的收集管內(nèi)，加入10 μL洗脫緩沖液，離心；再加入50 μL洗脫緩沖液，室溫靜置5 min；離心，收集流穿液，即為蛋白樣品。

1.4 SDS-PAGE檢測(cè)取1.3中的蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后用硝酸銀快速銀染試劑盒進(jìn)行凝膠染色。即先固定、乙醇洗滌、水洗、增敏、再水洗2次、銀染、水洗，然后顯色，最后終止顯色。

1.5 質(zhì)譜鑒定根據(jù)染色結(jié)果，對(duì)比樣品組與對(duì)照組，找出兩組之間的差異條帶。將剩下的蛋白樣品送至上海厚基生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜定性鑒定分析，以獲得該差異蛋白條帶的生物信息。即將溶液狀態(tài)樣品經(jīng)膠內(nèi)酶解后，采用毛細(xì)管高效液相色譜上樣檢測(cè)，之后用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.6 ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析用Maxquant軟件分析所獲得的原始數(shù)據(jù)，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。相關(guān)參數(shù)如下：Enzyme=Trypsin、Missed cleavage=2、Fixed modification：Carbamidomethyl（C），Variable modification：Oxidation（M）。樣品搜索使用Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索使用Uniprot數(shù)據(jù)庫：uniprot_Eimeria tenella 9318（數(shù)據(jù)庫包含9318 條序列)。Peptides tolerance：20 ppm，MS/MS tolerance：0.1 Da，Maxquant結(jié)果過濾參數(shù)為：fdr≤0.01。

2 結(jié)果

2.1 蟲體蛋白的SDS-PAGE分析取所提取的子孢子蛋白20 μL，混合5 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水中煮7 min至蛋白變性，然后用12% SDS-PAGE蛋白凝膠進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色2 h，脫色1 h，結(jié)果見圖1，條帶清晰，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 子孢子全蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of sporozoite proteins

2.2 免疫共沉淀產(chǎn)物的SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，單克隆抗體組與多克隆抗體組均有差異條帶（圖2）。

圖2 免疫共沉淀洗脫液SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of co-immunoprecipitation production

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析取免疫共沉淀樣品進(jìn)行ESI質(zhì)譜測(cè)試，鑒定結(jié)果見表1。共篩選出：Mb組145個(gè)、Mb-N組167個(gè)、Pb組227個(gè)、Pb-N組189個(gè)潛在蛋白。將篩選獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，取兩個(gè)樣品組中有而陰性對(duì)照組中沒有的，初步篩選獲得6個(gè)可能與EtCDPK3相互作用的蟲體相關(guān)蛋白（圖3、表2），包括ATP合成酶γ鏈（ATP synthase gama chain）、葡萄糖磷酸變位酶1（phosphoglucomutase/parafusin related protein 1，PGM1）、核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDK）、6-磷酸葡糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH）和2個(gè)未知保守蛋白。

表1 ESI質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果Table 1 ESI Mass Spectrometry results

圖3 免疫共沉淀洗脫液ESI質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果Fig.3 ESI mass spectrometry analysis of co-immunoprecipitation production

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲屬于頂復(fù)門原蟲，是雞球蟲病的主要病原體，其在7種感染雞的球蟲中致病力最強(qiáng)。柔嫩艾美耳球蟲主要寄生于雞的盲腸，因不斷產(chǎn)生裂殖子而反復(fù)入侵腸道上皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞受損，致使盲腸出血，造成感染雞死亡，給世界養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，雞球蟲病的防治主要依靠抗球蟲藥物預(yù)防和疫苗免疫[20-21]。然而，由于耐藥性、藥物殘留、疫苗的成本較高等問題，迫切需要新的防治辦法來控制球蟲病。由于球蟲生活史的復(fù)雜性，其感染和致病也是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，往往借助多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)球蟲入侵宿主細(xì)胞，從而介導(dǎo)球蟲的侵襲過程。EtCDPK3是鈣離子信號(hào)通路中的重要效應(yīng)分子，在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。然而，EtCDPK3對(duì)蟲體入侵宿主細(xì)胞過程的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制和靶點(diǎn)仍不清楚。

對(duì)EtCDPK3前期研究發(fā)現(xiàn)，抗rEtCDPK3的抗體能抑制子孢子入侵。然而對(duì)于EtCDPK3是如何促進(jìn)蟲體入侵宿主細(xì)胞以及在細(xì)胞內(nèi)的生長、發(fā)育、繁殖過程中發(fā)揮作用的，目前還不清楚。許多細(xì)胞過程利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用來傳遞和控制如生長、增殖和分化等一系列復(fù)雜的生物功能的信號(hào)[22]。目前，隨著蛋白質(zhì)互作研究的深入，研究方法也日漸成熟，如酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)、GST或His pull-down技術(shù)等。免疫共沉淀是研究蛋白和蛋白相互作用的一種常用方法，即用抗體去免疫沉淀特定抗原（誘餌蛋白）并且共沉淀任何與該抗原相互作用的蛋白（目標(biāo)蛋白）。本研究以EtCDPK3作為誘餌蛋白，通過免疫共沉淀方法獲取與其互作的蛋白。但由于蟲體全蛋白樣本量大，可能會(huì)造成假陽性或者非特異性吸附，而且傳統(tǒng)的免疫共沉淀使用蛋白A或者蛋白G來固定抗體，因此最終洗脫液中會(huì)含有相應(yīng)抗體的重鏈和輕鏈，二者遷移形成的條帶可能和目標(biāo)蛋白的條帶重合從而掩蓋重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Thermo Science Pierce免疫共沉淀（Co-IP）試劑盒可避免這一系列問題的產(chǎn)生。該方法是通過將純化的抗體直接固定在瓊脂糖基質(zhì)上，從蟲體全蛋白中分離天然蛋白復(fù)合體。通過共價(jià)偶聯(lián)抗體至胺基活化樹脂，從而避免假陽性和非特異性吸附的問題。此外，對(duì)抗體濃度以及反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)摸索和優(yōu)化，提高了實(shí)驗(yàn)的成功率。

表2 EtCDPK3免疫共沉淀產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜鑒定獲得的潛在相互作用的蛋白質(zhì)Table 2 Potential interaction proteins of EtCDPK3 obtained by mass spectrometry

篩選獲得的6個(gè)蛋白中，有2個(gè)保守的未知蛋白，另外4個(gè)中在其他物種研究較多的是核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDK），NDK是一種通過催化γ-磷酸從三磷酸核苷（nucleoside triphosphate，NTPs）轉(zhuǎn)向二磷酸核苷（nucleoside diphosphate，NDPs）進(jìn)而來平衡細(xì)胞內(nèi)NTPs池的一種可逆轉(zhuǎn)移酶[23]。NDK進(jìn)化比較保守，在真核生物和原核生物中都有表達(dá)[23]。NDK除了在核苷酸代謝中起基礎(chǔ)性作用外，還在蛋白質(zhì)組氨酸磷酸化、DNA切割/修復(fù)和基因調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[24-26]。在寄生蟲中，NDKs是錐蟲嘌呤回收途徑中的關(guān)鍵酶，參與維持宿主細(xì)胞的完整性，從而使得蟲體受益[27-28]。Vieira等[29]發(fā)現(xiàn)吡咯-吲哚酮（pyrrole-indolinone）SU11652可以抑制利什曼原蟲NDK從而起到藥物治療作用。在鈣離子作為第二信使的信號(hào)通路中，cAMP通過對(duì)PKA的作用間接作用于離子通道（Ca2+、Na+等），進(jìn)而傳遞胞外信號(hào)；cAMP的產(chǎn)生依賴于腺苷酸環(huán)化酶（AC）的作用，而NDK則是活化AC的關(guān)鍵分子[30]，因此，推測(cè)EtCDPK3和NDK相互作用將信號(hào)傳遞給下游分子。另一種研究較多的是6-磷酸葡糖酸脫氫酶（脫羧）（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH），其主要參與糖代謝。在先前的報(bào)道中，6PGDH的活性可被葡萄糖1，6-二磷酸抑制，二者共同參與磷酸戊糖途徑[31]。釀酒酵母6PGDH活性的變化與細(xì)胞間磷酸戊糖過程速率變化相似[32]。6PGDH是磷酸戊糖途徑的第三種酶，是細(xì)胞NADPH的主要生成因子。而NADPH作為電子供體來還原抗氧化劑-硫氧還蛋白或谷胱甘肽（GSSG）。因此，6PGDH在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激方面起著至關(guān)重要的作用[33]。ATP合成酶γ鏈（ATP synthase gama chain）是組成ATP合成酶的關(guān)鍵部分，而線粒體ATP 合成酶是線粒體氧化磷酸化的關(guān)鍵酶。ATP合酶γ亞基轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)導(dǎo)致構(gòu)象改變，然后合成ATP。ATP合成酶的活性受到代謝物（ADP；Ca2+；Mg2+等）和信號(hào)蛋白的調(diào)節(jié)[34-36]。我們推測(cè)，ATP合成酶在蟲體能量合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中是必須的。在研究cAMP與cGMP通路的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶促進(jìn)ATP的合成，ATP通過與AC及PKA調(diào)節(jié)著Ca2+通道[30]。在哺乳動(dòng)物中，葡萄糖磷酸變位酶1（phosphoglucomutase 1，PGM1）是一種重要的代謝酶，通過葡萄糖1-磷酸和6-磷酸葡萄糖的相互轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)糖酵解和糖異生之間的轉(zhuǎn)換[37]。Stiersa等[38]發(fā)現(xiàn)，PGM1缺乏引起的結(jié)構(gòu)紊亂是導(dǎo)致酶功能障礙的分子機(jī)制。以上4個(gè)潛在的可能與EtCDPK3發(fā)生相互作用的蛋白，多與糖代謝和能量轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的關(guān)系，我們推測(cè)這些蛋白在鈣離子信號(hào)通路中協(xié)助EtCDPK3執(zhí)行信號(hào)的傳遞，參與糖類代謝，提供能量。這些蛋白在球蟲生活史過程中發(fā)揮的功能目前還不清楚，推測(cè)這些蛋白在蟲體入侵宿主細(xì)胞時(shí)與EtCDPK3協(xié)同發(fā)揮作用，提供蟲體入侵宿主細(xì)胞時(shí)所需的能量。但他們是否是EtCDPK3的效應(yīng)分子，以及在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中是否發(fā)揮了一定的作用還有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果中，單克隆抗體（Mb）組篩選出145個(gè)潛在目的蛋白，而多克隆抗體（Pb）組則篩選出來227個(gè)潛在目的蛋白，這些蛋白數(shù)目并不一致，其中原因可能是多克隆抗體特異性較差，與非特異性抗體相互作用的蛋白也一同被沉淀和洗脫下來，因此其數(shù)目多于單克隆抗體組。單克隆抗體（Mb）組與其陰性對(duì)照（Mb-N）組相比，其陰性對(duì)照組有167個(gè)蛋白被檢測(cè)到，可能是蛋白與樹脂的非特異性結(jié)合造成的。

在獲得EtCDPK3免疫共沉淀產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，利用SDS-PAGE進(jìn)行分離，經(jīng)硝酸銀染色可見，與陰性對(duì)照組相比單克隆抗體樣品組（Mb）和多克隆抗體樣品組（Pb）的免疫共沉淀產(chǎn)物均有差異條帶；對(duì)獲得的差異蛋白帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析，獲得6個(gè)可能與EtCDPK3互作的蛋白。這些蛋白是否能夠與EtCDPK3發(fā)生互作并參與子孢子入侵宿主細(xì)胞過程，將在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。上述研究結(jié)果為弄清EtCDPK3在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ)。