曹旭陽，王宇飛，張志飛，魏笑笑，秦立廷，陳佶慧，滕巧泱，楊健美，劉芹防，陳鴻軍，李澤君，李景環(huán)，李雪松

（1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010022；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，青島 266000）

水禽細(xì)小病毒包括能造成雛鵝和雛番鴨高發(fā)病率及高死亡率的鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）和番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV），在臨床上屬于一種急性且具有高傳染性的病原[1-2]。據(jù)報(bào)道，鵝細(xì)小病毒（GPV）只感染雛鵝和雛番鴨并引發(fā)“小鵝瘟”[3-4]，并不能感染其他種類的鴨子。然而，近幾年，一種由新型鵝細(xì)小病毒（Novel goose parvovirus，NGPV）引發(fā)的“喙萎縮-侏儒癥（beak atrophy and dwarfism syndrome，BADS）”在我國(guó)各省的櫻桃谷鴨和番鴨中相繼暴發(fā)，感染持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，感染宿主更加廣泛[5-6]?；糂ADS病鴨的典型癥狀是喙萎縮、舌突出、生長(zhǎng)遲緩、麻痹和腹瀉，患鴨體重明顯下降且易骨折，該病導(dǎo)致僵鴨淘汰率高達(dá)80%，致使中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

NGPV是線性單鏈的DNA病毒，該病毒無囊膜包裹且呈二十面體形態(tài)[8]。基因組包含兩個(gè)ORFs，其中右側(cè)的ORF框能編碼3種衣殼蛋白質(zhì)，分別命名為VP1、VP2和VP3蛋白[9]。其中VP3蛋白是構(gòu)成病毒衣殼的主要蛋白，約占衣殼蛋白總量的80%，攜帶與受體結(jié)合的保護(hù)性抗原且最為保守穩(wěn)定，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，常被用做基因工程目的抗原[10]。

目前檢測(cè)NGPV的方法主要有傳統(tǒng)的病毒分離、套式PCR法[11]、地高辛標(biāo)記的核酸探針法[12]、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法[5]等，但現(xiàn)有的各種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的病毒分離，耗時(shí)且步驟繁瑣。套式PCR法，雖然具有高敏感性和特異性，但不易定量，不易大批量檢測(cè)。地高辛標(biāo)記的核酸探針法，雖然具有更高的穩(wěn)定性和特異性，能夠克服常規(guī)PCR方法出現(xiàn)的假陽性，但其敏感性略低于PCR法，且不能對(duì)病毒拷貝數(shù)進(jìn)行定量。熒光定量PCR（FQ-PCR）能夠通過熒光信號(hào)強(qiáng)度來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，通過陽性標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出目的基因的初始量，即能定性又能定量。此方法具有特異性強(qiáng)、高效、快速、靈敏度高且適用于大規(guī)模檢樣等優(yōu)點(diǎn)，因此在分子檢樣中得到廣泛應(yīng)用[13-15]。本研究通過優(yōu)化各種條件建立了一種敏感性高、特異性好的NGPV熒光定量PCR方法，并通過現(xiàn)地臨床樣品檢測(cè)證明該方法具有良好的應(yīng)用性和準(zhǔn)確性，為該病原的臨床檢測(cè)提供一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株NGPV（鴨源新型鵝細(xì)小病毒）（A244株）、DRV（鴨呼腸孤病毒）、DTMUV（鴨坦布蘇病毒）、GPV（鵝細(xì)小病毒）、DEV（鴨病毒性腸炎病毒）、MDPV（番鴨細(xì)小病毒）、H9亞型AIV（H9亞型禽流感病毒）、DHAV-I（I型鴨型肝炎病毒）、DHAV-Ⅲ（Ⅲ型鴨型肝炎病毒）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物感染與禽新發(fā)病毒病團(tuán)隊(duì)保存和提供。

1.2 主要試劑Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，DNA純化回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自諾唯贊公司，小劑量質(zhì)粒（去內(nèi)毒素）抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，Premix ExTaq（Probe qPCR）試劑盒和pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 特異引物與探針的設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank上的NGPV序列，設(shè)計(jì)了關(guān)于VP3基因的1條特異探針TaqMan5'-FAM-GPV-P，其序列為5'-FAMCAAGTCAARGAAGTCACAACGCA-BHQ1-3'以及1對(duì)適用于熒光定量PCR的引物，NGPV-VP3-F和NGPV-VP3-R，其序列分別為5'-CCCAAGTC TCTTAAATTCAAG-3'，5'-CCCAGGACATACG GGAGTTG-3'，擴(kuò)增片段為143 bp。

1.4 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備根據(jù)Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒說明書提取NGPV的DNA，并以NGPV的DNA為模板，使用1.3中的NGPV-VP3-F和NGPVVP3-R，通過Premix Ex-Taq進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增NGPV的VP3基因片段，該目的片段大小為143 bp。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。把目的片段切膠回收純化后克隆至pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，送金唯智公司測(cè)序鑒定。按照小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取序列正確的陽性質(zhì)粒pMD19-VP3（143 bp）作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)其濃度并計(jì)算出陽性標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化以1.4中已知拷貝數(shù)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品pMD19-VP3（143 bp）作為模板，利用Premix Ex-Taq（Probe qPCR）試劑盒中的試劑，總體系為20 μL，將探針和引物進(jìn)行不同濃度的配比（濃度控制在0.2～1 μmol/L）來選擇最佳濃度，根據(jù)SeqMan軟件設(shè)計(jì)提供的引物與探針的最佳退火溫度來調(diào)整反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間（Tm為56℃～60℃，T為20 s～40 s），循環(huán)參數(shù)分別為35、40和45，按照以上條件一一進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性將1.4中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品pMD19-VP3（143 bp）按照10倍倍比稀釋，并且每個(gè)稀釋度做兩次重復(fù)，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)10倍倍比稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行普通PCR。

1.7 熒光定量PCR的特異性試驗(yàn)根據(jù)Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒提取GPV、MDPV的DNA，用天根病毒RNA病毒提取試劑盒提取H9亞型AIV、Ⅰ型DHAV、Ⅲ型DHAV、DRV和DTMUV的RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用1.5建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)NGPV的核酸以及GPV、DTMUV、DRV、DEV、MDPV、H9AIV、DHAV-Ⅰ、DHAV-Ⅲ的核酸（DNA和cDNA）進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證本方法的特異性。

1.8 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)將3.72×107、3.72×105、3.72×103拷貝/μL的NGPV陽性標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，利用建立的定量PCR檢測(cè)方法，并通過數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

1.9 臨床樣品檢測(cè)利用建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法和常規(guī)PCR方法，對(duì)采集自山東和江蘇等地區(qū)的50份疑似感染NGPV的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，以確定本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法的臨床應(yīng)用性檢測(cè)效果。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度的換算小劑量抽提的陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為200 ng/μL，根據(jù)公式換算后其拷貝數(shù)為3.72×107拷貝/μL。

2.2 反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化結(jié)果以陽性標(biāo)準(zhǔn)品pMD19-VP3（143 bp）為模板，1.3中設(shè)計(jì)的VP3基因上下游引物濃度為0.4 μmol/L，探針濃度為0.8 μmol/L，熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸34 s，40個(gè)循環(huán)；并于每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。結(jié)果表明，在此條件和反應(yīng)程序中，可以檢測(cè)到陽性標(biāo)準(zhǔn)品的最小Ct值，擴(kuò)增曲線呈典型的S型。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性試驗(yàn)結(jié)果將1.4中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品pMD19-VP3（143 bp）按照10倍倍比稀釋，梯度為3.72×109拷貝/μL～3.72×101拷貝/μL進(jìn)行常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。常規(guī)的PCR方法只能檢測(cè)到3.72×103拷貝/μL的陽性質(zhì)粒模板，而熒光定量PCR方法卻能檢測(cè)到37.2拷貝數(shù)/μL的陽性質(zhì)粒模板，這說明熒光定量PCR方法的靈敏度比常規(guī)PCR方法高100倍。由圖1可知，梯度稀釋的陽性質(zhì)粒模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性，其擴(kuò)增方程式為Y=-3.456X+42.26，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.991，并且重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果一致，表明該方法具有良好的擴(kuò)增效率。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法同時(shí)檢測(cè)NGPV的核酸以及GPV、DTMUV、DRV、DEV、MDPV、AIV、DHAV-Ⅰ和DHAV-Ⅱ的核酸，結(jié)果顯示（圖3），該定量PCR方法能特異性的檢測(cè)到NGPV核酸，出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線，而其他8種鴨主要病原的核酸檢測(cè)均為陰性，說明本試驗(yàn)的引物與探針以及所建立的方法特異性良好，與其他鴨源病毒陽性樣品均無交叉反應(yīng)現(xiàn)象。

圖1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of the real-time PCR

圖2 熒光定量PCR（A）和常規(guī)普通PCR（B）敏感性比較Fig.2 Comparison of the sensitivity of real-time PCR (A) and conventional PCR (B)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果利用本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法同時(shí)檢測(cè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品中的3.72×107、3.72×105、3.72×103拷貝/μL樣品，進(jìn)行3次熒光定量PCR檢測(cè)，并且每個(gè)陽性樣品做3個(gè)重復(fù)。結(jié)果顯示：該方法的批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)CV在0.68%～1.81%，批間重復(fù)性變異系數(shù)CV在1.36%～2.20%，說明此方法的重復(fù)性良好。

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果利用建立好的熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)來自山東和江蘇等地區(qū)的50份疑似NGPV感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，在50例樣品中，TaqMan熒光定量PCR方法檢測(cè)其中的39例樣本為NGPV陽性，檢出率為78%，常規(guī)PCR只檢測(cè)出25例樣本為NGPV陽性，檢出率為50%（表2）。

3 討論

圖3 特異性熒光定量PCR檢測(cè)Fig.3 Specific detection of the real-time PCR

表2 應(yīng)用熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)臨床樣品Table 2 Results of NGPV detection by real-time PCR and conventional PCR for clinical samples

1956年，方定一[4]首次發(fā)現(xiàn)了GPV，隨后Derzy[16]對(duì)該病原進(jìn)行了更全面的研究。1971年后，在歐洲以及亞洲陸續(xù)報(bào)道一種新型鵝細(xì)小病毒（NGPV），我國(guó)也從2014年開始，山東、浙江、廣西、江蘇、福建等地區(qū)鴨群暴發(fā)類似于“喙萎縮-侏儒癥”（BADS）的疾病[5]。吳蓓等[17]通過特異性引物對(duì)山東地區(qū)不同病死鴨群的10個(gè)臟器進(jìn)行NGPV的普通PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鴨群個(gè)體平均感染率為82.5%，其中心臟在各臟器中檢出率最高，可達(dá)到82.5%。該病毒可水平亦可垂直傳播給雛鴨[18]，病發(fā)日齡多為10～40 d，不僅影響肉鴨體重，還導(dǎo)致病死率大幅增加。目前，該病給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)已造成嚴(yán)重的損失。本研究建立了一種快速且敏感的檢測(cè)NGPV的方法，以期為該病原的診斷提供一種初步有效的手段。

檢測(cè)病毒的方法很多，包括免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。免疫學(xué)方法有一定的誤差，而分子生物學(xué)方法更為精確。分子生物學(xué)常用的方法是熒光定量PCR[19-20]。TaqMan探針法是一種由核酸設(shè)計(jì)的引物和探針，具有高度特異性，同時(shí)比普通PCR結(jié)果更直觀、精確。本研究根據(jù)NGPV相對(duì)保守的VP3基因序列，利用SeqMan軟件設(shè)計(jì)了特異的引物與探針（長(zhǎng)度最好在20～30 bp）并建立了熒光定量PCR，優(yōu)化其引物、探針的濃度以及反應(yīng)條件以達(dá)到最好的檢測(cè)效果，并且通過與常規(guī)PCR的敏感性試驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法比普通PCR方法高100倍，且能根據(jù)陽性標(biāo)準(zhǔn)品定量，而且本方法具有重復(fù)性好和特異高的特點(diǎn)。相比于已建立的NGPV熒光定量PCR方法外[19-20]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了熒光定量PCR與普通PCR的敏感性對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以確立建立的熒光定量方法的有效性，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品載體所需的目的片段只有143 bp，最低檢測(cè)拷貝數(shù)可達(dá)37個(gè)拷貝數(shù)，比之前的方法略敏感，在特異性檢測(cè)方面選擇了8種病毒進(jìn)行驗(yàn)證，相比于前者特異性的檢測(cè)更加的全面。因此，本研究建立的NGPV TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)于NGPV的檢測(cè)具有準(zhǔn)確性高、敏感性和特異性好、應(yīng)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)該病的早期診斷、疾病防控具有重要的意義。