張經(jīng)偉，王 晗，劉 靖，馬 樂，李 偉，步志高，華榮虹

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150069）

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）屬黃病毒科黃病毒屬，經(jīng)伊蚊傳播，兔、豬和人對其易感[1]，是一種重要的人獸共患病病原。該病毒最早于1947年在烏干達(dá)寨卡森林中的恒河猴體內(nèi)分離出來[2]。ZIKV病毒粒子呈球形，外有一層囊膜包裹，基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長度約11 kb，從5'端開始編碼C蛋白（核衣殼蛋白）、prM蛋白（囊膜蛋白）和E蛋白（囊膜糖蛋白）3種結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5 7種非結(jié)構(gòu)蛋白[3]。目前，依據(jù)分子生物學(xué)和生物信息學(xué)可將其分為亞洲型和非洲型2種亞型[4]。

ZIKV感染宿主后能引起寨卡熱。大多數(shù)感染者并沒有明顯癥狀或者癥狀較為輕微，包括發(fā)熱、皮疹、結(jié)膜炎、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，病程約2～7 d。但若在懷孕期間發(fā)生感染可能使出生胎兒患有小頭癥和其他先天性畸形，同時(shí)還可能造成早產(chǎn)或流產(chǎn)等嚴(yán)重癥狀[5-6]。

ZIKV在全球范圍內(nèi)呈蔓延趨勢，目前，我國雖無相關(guān)重大疫情的報(bào)道，但其對于我國仍具有潛在威脅[7]。本研究對ZIKV C、prM和E基因進(jìn)行克隆并構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過純化蛋白并免疫新西蘭大白兔成功制備抗ZIKV C、prM和E基因的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究該病毒的致病機(jī)制及建立ZIKV感染快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；ZIKV由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；DMEM、胎牛血清、Opti-MEM、胰酶和青鏈霉素混合液購自GIBCO公司；Triton X-100購自Sigma公司；Albumin Bovine V購自Biotopped公司；佐劑MONTANIDETM ISA 61 VG購自SEPPIC公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自中山金橋公司；鼠抗MBP單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 ZIKV結(jié)構(gòu)蛋白C、prM和E全長cDNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GenBank公布的ZIKV（FSS13025株）基因編碼序列，將C、prM和E基因的密碼子針對大腸桿菌進(jìn)行優(yōu)化，合成并分別克隆至pMAL-c5x載體中，構(gòu)建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表達(dá)重組質(zhì)粒。

1.3 重組質(zhì)粒表達(dá)、鑒定與純化將pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表達(dá)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至ER2523感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選后挑取單個(gè)菌落于4 mL氨 抗性LB中，37℃搖床220×g培養(yǎng)12～16 h后，按1∶100接種于100 mL LB培養(yǎng)基至D600為0.6～0.8，加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG后繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h。將誘導(dǎo)菌液離心經(jīng)超聲破碎后，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定蛋白表達(dá)情況。重組表達(dá)蛋白經(jīng)MBP親和層析柱純化并鑒定后，置于-80℃保存。

1.4 ZIKV結(jié)構(gòu)蛋白C、prM和E多克隆抗體的制備將重組蛋白與MONTANIDETM ISA 61 VG佐劑按重量比為6∶4比例充分乳化，進(jìn)行免疫，首免時(shí)將佐劑與蛋白混勻并充分乳化后背部皮下注射新西蘭大白兔，免疫劑量為300 μg/只。在3周和6周后分別進(jìn)行二免和三免。三免7 d后心臟采血并分離血清。

1.5 多克隆抗體免疫反應(yīng)性及效價(jià)檢測將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ZIKV接種于BHK-21細(xì)胞，經(jīng)72 h后收集細(xì)胞沉淀，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂乳室溫封閉2 h，以制備的多抗（1∶200）作為一抗，以紅外熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）進(jìn)行Western blot檢測。同時(shí)將BHK-21細(xì)胞感染ZIKV，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)48 h后，用PBS洗滌1次，再用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞10 min，用PBS洗已固定細(xì)胞3次，每次5 min，用0.1% triton X-100作用10 min，PBS洗1次后加入稀釋的兔血清，以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200）為二抗進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)ZIKV結(jié)構(gòu)蛋白C，prM和E全長cDNA的構(gòu)建與鑒定根據(jù)GenBank公布的ZIKV C、prM和E蛋白編碼序列，對C、prM和E蛋白基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化后人工合成，將合成基因分別克隆至pMAL-c5x載體，經(jīng)鑒定后成功構(gòu)建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表達(dá)重組質(zhì)粒（圖1）。

圖1 pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E雙酶切鑒定Fig.1 Identification of pMAL-c5x-ZIKV-C, pMAL-c5x-ZIKV-prM and pMAL-c5x-ZIKV-E by Not I and BamH I

2.2 重組蛋白表達(dá)、純化與鑒定將pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E分別轉(zhuǎn)化至ER2523感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定，分析蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pMAL-c5x-ZIKV-C（圖2）、pMAL-c5x-ZIKV-prM（圖3）和pMAL-c5x-ZIKV-E（圖4）表達(dá)產(chǎn)物分別在55 kDa、60 kDa和100 kDa左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小一致。

圖2 SDS-PAGE(A、B)和Western blot(C)驗(yàn)證可溶性ZIKV-C蛋白表達(dá)與純化Fig.2 Identification of expression and purification results of ZIKV-C by SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C)

圖3 SDS-PAGE(A、B)和Western blot (C)驗(yàn)證可溶性ZIKV-prM蛋白表達(dá)與純化Fig.3 Identification of expression and purification results of ZIKV-prM by SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C)

圖4 SDS-PAGE(A、B)和Western blot(C)驗(yàn)證可溶性ZIKV-E蛋白表達(dá)與純化Fig.4 Identification of expression and purification of ZIKV-E by SDS-PAGE(A, B) and Western blot (C)

2.3 多克隆抗體免疫反應(yīng)性及效價(jià)檢測利用3次免疫后獲得的兔血清為一抗，紅外熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western blot，分別檢測血清中多克隆抗體的特異性，結(jié)果在相對分子質(zhì)量14 kDa、17 kDa和55 kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖5）。IFA檢測結(jié)果顯示，所制備的3種血清抗體均能與ZIKV感染的細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生亮綠色熒光信號，而陰性對照兔血清則無熒光信號產(chǎn)生（圖6）。結(jié)果表明所制備的抗C蛋白、prM蛋白以及E蛋白血清均能與ZIKV特異性結(jié)合，可以用于間接免疫熒光試驗(yàn)分析。將各血清抗體進(jìn)行梯度稀釋檢測結(jié)果表明，anti-C、anti-prM、anti-E血清抗體IFA的效價(jià)分別為1∶1600、1∶1600和1∶3200。

圖5 Western blot鑒定結(jié)果Fig.5 The results of Western blot

3 討論

ZIKV是一種重要的人獸共患病病原，成年人感染后一般無明顯癥狀，少數(shù)人會出現(xiàn)如格林巴利綜合征等嚴(yán)重癥狀[8-9]，懷孕期間ZIKV感染會導(dǎo)致新生兒出生缺陷如小頭癥等[10]。目前，我國雖無相關(guān)重大疫情的報(bào)道，但已有相關(guān)研究顯示ZIKV對豬具有易感性[7]，對于我國養(yǎng)豬業(yè)具有潛在重大威脅。但是，由于目前尚無有效治療辦法，因此，預(yù)防ZIKV儲備疫苗的研制迫在眉睫。

黃病毒屬的病毒抗原結(jié)構(gòu)基本類似，其結(jié)構(gòu)蛋白決定免疫原性與細(xì)胞嗜性。然而，ZIKV在許多方面與其他黃病毒不同，例如，其可以通過體液傳播，胎盤感染以及造成新生兒缺陷[11]。ZIKV C、M和E結(jié)構(gòu)蛋白均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。衣殼蛋白（C）是一種多功能蛋白，其在核衣殼組裝過程中與病毒RNA結(jié)合，通過與細(xì)胞蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。膜蛋白（M）由prM蛋白前體經(jīng)酶剪切而來且prM蛋白對于病毒成熟、出芽和分泌十分重要[12]。囊膜蛋白（E）參與病毒與受體結(jié)合，膜融合以及宿主免疫識別，其包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域：負(fù)責(zé)錨定胞膜的莖-跨膜結(jié)構(gòu)域以組成蛋白質(zhì)剩余主要β鏈表面部分的結(jié)構(gòu)域Ⅰ（DomainⅠ，D Ⅰ）、Ⅱ和Ⅲ，DⅡ連接DⅠ和DⅢ[13]。DⅢ既是病毒與宿主細(xì)胞吸附的關(guān)鍵區(qū)域，也是最主要的抗原區(qū)域[14]。

多克隆抗體具有制備過程相對簡單、成本低以及周期短的優(yōu)點(diǎn)[15]，并且其可以識別相應(yīng)抗原的多個(gè)抗原表位，增強(qiáng)靶蛋白信號，提高其檢測靈敏度[16]。本研究通過優(yōu)化密碼子序列，同時(shí)利用大腸埃希菌表達(dá)目的基因蛋白產(chǎn)量大，培養(yǎng)條件相對簡單和生長速度快等優(yōu)點(diǎn)成功表達(dá)出ZIKV C、prM和E蛋白，經(jīng)MBP柱純化后制備相應(yīng)抗原，免疫新西蘭大白兔，IFA和Western blot結(jié)果顯示成功制備了C、prM和E蛋白多克隆抗體，且具有良好的特異性，其中C蛋白多克隆抗體與ZIKV反應(yīng)性較弱，經(jīng)分析原因推測：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對象健康狀況不佳；②產(chǎn)生大量非特異抗體致使其反應(yīng)性太差；③由于抗原具有多個(gè)表位，存在交叉反應(yīng)。

圖6 IFA鑒定C、prM、E蛋白多克隆抗體與ZIKV的反應(yīng)性Fig.6 Detection of ZIKV by IFA with polyclonal antibodies against C, prM and E protein, respectively

本研究制備的多克隆抗體不僅可用于M和E蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究，同時(shí)也為建立ZIKV感染快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)。