牛登云，徐兆強(qiáng)，陳 卓，馬利芳，段寶敏，張小敏，馮敬敬

（天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司，天津 300308）

I群禽腺病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，為雙鏈DNA病毒，無(wú)囊膜，直徑為70～90 nm，呈20面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。六鄰體（Hexon）是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，含有型、群和亞群的特異性抗原決定簇[1]。Hexon蛋白由Hexon基因編碼，ORF全長(zhǎng)2829 bp，編碼943個(gè)氨基酸，其抗原性強(qiáng)、暴露性好、具有群特異性[2]。

I群禽腺病毒除引起雞包涵體肝炎、心包積水綜合征外還會(huì)引起產(chǎn)蛋下降和肌胃糜爛等癥狀。垂直傳播是該病的主要傳播方式，水平傳播也很重要。I群禽腺病毒共12個(gè)血清型，且含有相同的群抗原[3]。FAdV-4可引起心包積水綜合征，F(xiàn)AdV-8b型可引起包涵體肝炎，其他血清型沒(méi)有較為明顯的臨床癥狀[4]。實(shí)驗(yàn)室分離該病主要接種雞肝癌細(xì)胞（chicken liver cancer cell，LMH）、雞胚腎細(xì)胞（chicken embryo kidney cells，CEK），而對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞[1]和氣管培養(yǎng)物不敏感[5]。通過(guò)接種雞胚絨毛尿囊膜可以分離該病毒，但Cowen通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明卵黃囊接種是一種分離該病毒的敏感途徑[6]。

禽腺病毒廣泛存在于雞群中，特點(diǎn)就是感染率高、病原復(fù)雜，常與一些能導(dǎo)致禽類(lèi)呼吸道疾病相關(guān)的病原微生物混合感染或者在免疫抑制時(shí)發(fā)生疾病，從而造成嚴(yán)重的損失，現(xiàn)在該病在所有養(yǎng)禽的國(guó)家基本上均有發(fā)生，對(duì)于該病的防控已經(jīng)成為國(guó)際禽病研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。2015-2016年，作者在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)I群禽腺病毒的進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)腺病毒的流行毒株以FAdV-4型為主且呈現(xiàn)由點(diǎn)到面的暴發(fā)趨勢(shì)，零星出現(xiàn)FAdV-8b型，沒(méi)有其他血清型的出現(xiàn)，且不同時(shí)間和地域分離到的FAdV-4型流行毒株其Hexon同源性均在98%以上，F(xiàn)AdV-8b型毒株也是如此；2017-2018年主要以基因型D型為主，其中包括FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9和FAdV-11，但仍然以FAdV-4型為主[7]。

2017-2018 年共收集到220余份FAdV陽(yáng)性樣品，覆蓋全國(guó)范圍內(nèi)各省份和地區(qū)的肉雞、蛋雞和水禽，且全部進(jìn)行了病毒分離和鑒定，結(jié)果顯示，分離的毒株主要以FAdV-4和FAdV-11為主，還有FAdV-1和FAdV-8毒株，1株FAdV-3。迄今為止，關(guān)于FAdV-3型禽腺病毒的相關(guān)文獻(xiàn)相對(duì)較少，該病毒的致病特性、適應(yīng)性、所引起的臨床癥狀等研究較少，所以本研究選擇對(duì)該病毒進(jìn)行分離鑒定，以期為其相關(guān)性研究和后續(xù)產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、菌株和載體LMH細(xì)胞由本公司研發(fā)中心贈(zèng)送，宿主菌E.coliDH5α和載體pMD18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 臨床樣本臨床樣本為2018年進(jìn)行FAdV流行病學(xué)調(diào)查中經(jīng)PCR鑒定為FAdV核酸陽(yáng)性的肝臟樣本。

1.3 病毒分離培養(yǎng)樣本處理按照如下方法進(jìn)行，采集肝臟剪碎與無(wú)菌PBS等體積融合后研磨，收集研磨液于離心管中，10 000×g離心5 min，取上清液通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，所得樣本即為待分離樣本。將LMH細(xì)胞復(fù)蘇，采用10%胎牛血清DMEM-F12生長(zhǎng)液，傳代至穩(wěn)定生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至75%～90%時(shí)，棄掉生長(zhǎng)液，按培養(yǎng)液體積的1/10接種待分離樣本，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，棄掉液體，立即加入2%胎牛血清的DMEM-F12維持液繼續(xù)培養(yǎng)2～5 d，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和病變（cytopathic effect，CPE）情況，若無(wú)CPE出現(xiàn)，則培養(yǎng)至第5 d后將細(xì)胞凍融3次后繼續(xù)傳代，傳至3代仍無(wú)細(xì)胞病變則視為病毒樣本陰性，若出現(xiàn)CPE則連續(xù)傳3代，3代均有CPE的則視為有病毒，凍融3次后收獲病毒，置-80℃條件下保存待鑒定。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)物的PCR鑒定將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物采用PCR進(jìn)行初步鑒定，采用全式金病毒病毒DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR鑒定過(guò)程參照文獻(xiàn)方法對(duì)Hexon基因進(jìn)行擴(kuò)增[8]，且自行設(shè)計(jì)了針對(duì)FAdV-I群禽病毒通用引物，上游引物-F：5'-TGGACATGGGGGCGAC CTA-3'，下游引物-R：5'-TTGCCTGTGGCGAAAG GCG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2500 bp。同時(shí)使用未接毒LMH細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.5 Hexon基因的擴(kuò)增和測(cè)序利用Hexon基因擴(kuò)增引物對(duì)收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行Hexon基因片段的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，其中dNTP 4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，上、下游引物各2.5 μL，Ex-TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA 5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min；67℃退火1 min；72℃延伸3 min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物膠回收后連接pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆菌落，37℃過(guò)夜搖菌，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的樣品送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 病毒細(xì)胞半數(shù)感染量測(cè)定將PCR鑒定為陽(yáng)性的分離株采用Reed-Muench方法進(jìn)行病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（tissue culture infective dose, TCID50）測(cè)定。

1.7 雞胚致病性檢驗(yàn)及分析將PCR鑒定為陽(yáng)性的分離株通過(guò)絨毛尿囊膜接種雞胚，0.1 mL/枚，連續(xù)培養(yǎng)5 d，觀察雞胚死亡情況及胚體病變情況。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本剖檢臨床樣本來(lái)源于陜西省延安市某養(yǎng)殖場(chǎng)，全場(chǎng)養(yǎng)殖量在10萬(wàn)羽左右。此次分離樣本為商品代海藍(lán)褐，17周齡開(kāi)始發(fā)病，精神萎靡，羽毛蓬松，采食量下降，產(chǎn)蛋下降，19周齡死亡，PCR初步鑒定為FAdV和H9混合感染。剖檢可見(jiàn)肝臟和腎臟出血、腫大（圖1），胸腺呈現(xiàn)深紅褐色，心臟有少部分壞死灶，法氏囊未見(jiàn)腫大和出血。

圖1 臨床樣本剖檢Fig.1 Clinical sample profile

2.2 病毒分離結(jié)果將處理后的肝臟接種LMH細(xì)胞，24 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)CPE產(chǎn)生，48 h后產(chǎn)生較明顯的CPE，病變主要表現(xiàn)為細(xì)胞增大、變圓，折光度增高，貼壁性減弱，呈半懸浮狀態(tài)。LMH細(xì)胞對(duì)照組無(wú)CPE出現(xiàn)。出現(xiàn)CPE的病毒傳到第2～3代時(shí)，24 h細(xì)胞即可產(chǎn)生明顯的CPE，96 h內(nèi)90%細(xì)胞完全病變脫落（圖2）。

圖2 LMH細(xì)胞接種結(jié)果Fig.2 The result of LMH cell infection

2.3 PCR鑒定結(jié)果將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物采用PCR的方法進(jìn)行初步鑒定后，細(xì)胞培養(yǎng)物在2500 bp位置有一條目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，而正常LMH細(xì)胞為陰性，初步表明細(xì)胞培養(yǎng)物中有FAdV（圖3）。

圖3 分離株Hexon基因PCR鑒定Fig.3 The PCR identification of Hexon gene from isolate

2.4 Hexon基因同源性分析將測(cè)序得到的Hexon基因序列與GenBank上登錄的12個(gè)血清型進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與FAdV-3參考毒株SR-49同源性為99.4%（圖4）。與參考序列的Hexon基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，20 534、20 971、21 067、21 167、21 670、21 703、21 838、21 844、21 865位點(diǎn)出現(xiàn)堿基突變，20 308位點(diǎn)出現(xiàn)堿基缺失（圖5）。

圖4 同源性分析結(jié)果Fig.4 Homology analysis results

圖5 Hexon基因堿基變異區(qū)域比較Fig.5 The comparison of Hexon gene nucleotide variation region between SR-49 and SX180203

2.5 Hexon基因系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA 6.0軟件對(duì)分離株株Hexon基因序列建立基因進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)FAdV的基因型將其進(jìn)行分組。從進(jìn)化樹(shù)分支和遺傳距離可以發(fā)現(xiàn)，本研究分離的腺病毒與FAdV-3參考毒株位于基因進(jìn)化樹(shù)的同一分支上，基因型為D型，血清型為3型（圖5）。

2.6 病毒TCID50測(cè)定將該毒株進(jìn)行TCID50測(cè)定，按照Reed-Muench方法計(jì)算，得出TCID50為10-7.67/0.1 mL。

2.7 雞胚致病性檢驗(yàn)將分離毒株經(jīng)絨毛尿囊膜接種至9～11日齡SPF雞胚，陰性對(duì)照組接種無(wú)菌PBS。結(jié)果顯示：分離毒株接種48 h時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)死胚，96 h后雞胚全部死亡，對(duì)照組全部正常；分離毒株接種的雞胚胚體發(fā)紅矮小、發(fā)育不良，剖檢可見(jiàn)肝臟出血、有壞死灶，對(duì)照組正常（圖7）。

3 討論

圖6 進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果Fig.6 Evolutionary tree analysis

圖7 雞胚接種結(jié)果Fig.7 Results of chicken embryo inoculation

Ⅰ群禽腺病毒（FAV-I）主要流行于肉仔雞飼養(yǎng)地區(qū)，以2～5周齡的肉雞多發(fā)，也有10日齡以?xún)?nèi)發(fā)病的報(bào)道[9]。在同一農(nóng)場(chǎng)中可以存在幾種不同血清型，其中以血清型FAdV-4引起的肝炎-心包積水綜合征（HHS）和基因D型引起的雞包涵體肝炎（IBH）最為常見(jiàn)，可作為原發(fā)性病原誘發(fā)疾病[10]，不同血清型對(duì)禽類(lèi)致病性各有不同，所以對(duì)不同血清型腺病毒的分離鑒定及相關(guān)研究尤為重要。目前我國(guó)流行的FAV-I主要是FAdV-4、FAdV-8b、FAdV-11，在臨床上主要的預(yù)防措施是疫苗免疫，且自家苗較多，隨之而來(lái)的病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)增加，根據(jù)2015-2018年本實(shí)驗(yàn)室對(duì)FAV-Ⅰ的分子流行病學(xué)調(diào)查得到，F(xiàn)AV-Ⅰ感染呈現(xiàn)逐年增加的態(tài)勢(shì)，且感染宿主從以蛋雞、肉雞為主遍布到水禽、飛禽均可易感，以CAV、CIA、IBD等免疫抑制病混合感染為主，同一機(jī)體發(fā)病也會(huì)出現(xiàn)多種血清型腺病毒混合感染的情況，發(fā)病省份也從京、津、冀、魯?shù)貐^(qū)向全國(guó)各省份蔓延，演變成從一種少見(jiàn)疾病到常態(tài)化疾病[7]。縱觀近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)禽腺病毒的研究，大多只針對(duì)肝炎-心包積水綜合征和雞包涵體肝炎的誘發(fā)病原，而對(duì)FAdV-3型的相關(guān)研究文獻(xiàn)少之又少，雖然FAdV-3型只是少量出現(xiàn)，但不排除會(huì)出現(xiàn)像FAdV-4型由點(diǎn)到面的暴發(fā)趨勢(shì)，因此應(yīng)盡早做好預(yù)防工作。

本研究成功分離到1株I群禽腺病毒病毒，命名為SX180203，該分離株能感染LMH細(xì)胞，使細(xì)胞形態(tài)變圓、變大、貼壁性減弱，在雞胚感染過(guò)程中，能使雞胚胚體發(fā)育不良、肝臟出血壞死。該分離株不具備凝集大鼠和家禽紅細(xì)胞的功能，對(duì)脂溶劑有抵抗力，能耐受弱酸、弱堿。這些生物學(xué)特征與I群禽腺病毒特征一致。通過(guò)對(duì)該分離株的Hexon基因進(jìn)行測(cè)序分析，并與12個(gè)血清型的FAdV進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與3型參考毒株SR-49同源性為99.4%，序列遺傳進(jìn)化樹(shù)也顯示分離株與SR-49參考毒株屬于同一分支，因此證明本研究分離株為I群禽腺病毒，血清型為3型，基因型為D型，且與參考序列核苷酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，有9個(gè)堿基位點(diǎn)出現(xiàn)變異，一個(gè)堿基位點(diǎn)缺失，說(shuō)明FAdV-3型腺病毒出現(xiàn)了核苷酸變異，同時(shí)該分離株也為禽腺病毒血清3型毒株疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。