高 俐，祁艷艷，崔藝璇，劉 寬，蔡正達(dá)，李干鵬，楊 淬

(1. 云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2. 云南省科學(xué)技術(shù)院，云南 昆明 650228)

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病，其機(jī)理研究表明糖脂代謝紊亂不僅是糖尿病發(fā)生發(fā)展的主要因素，也是導(dǎo)致糖尿病患者血管病變的主要原因[1-3]。相關(guān)研究表明糖脂代謝過(guò)程在糖尿病等代謝綜合征的病理生理過(guò)程中扮演重要的角色，找到糖脂代謝過(guò)程的相關(guān)靶點(diǎn)并對(duì)其糖脂代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，是突破糖尿病以至代謝綜合征治療的重要方向。

瞬時(shí)受體電位(TRP)通道是一個(gè)大家族，分為T(mén)RPC、TRPV和TRPM通道亞型，在體內(nèi)分布廣泛，參與調(diào)節(jié)血液循環(huán)、腸蠕動(dòng)、礦物質(zhì)吸收、體液平衡、氣道和膀胱的超敏性以及細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育等，TRPC離子通道是位于細(xì)胞膜上的一類(lèi)非選擇性陽(yáng)離子通道，主要介導(dǎo)磷脂酶依賴(lài)鈣離子的內(nèi)流[4-7]。有研究表明[8]，TRPC4通道為去極化和鈣流入胰島素分泌細(xì)胞的途徑之一，而TRPC5與糖尿病腎病有重要關(guān)系，抑制TRPC5基因可以緩解糖尿病腎病癥狀[9]。TRPC4與TRPC5具有高度同源性[10]，二者均與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有聯(lián)系，但其詳細(xì)的病理生理機(jī)制并未明確。TRPC5主要在外周表達(dá)，目前對(duì)其在體內(nèi)調(diào)節(jié)作用知之甚少。本研究使用TRPC5基因敲除小鼠，在正常與高糖環(huán)境下分別檢測(cè)小鼠體內(nèi)與糖脂代謝過(guò)程相關(guān)的生化指標(biāo)，旨在探討TRPC5對(duì)糖脂代謝的影響，從而進(jìn)一步闡明TRPC5在糖尿病病理過(guò)程中的作用機(jī)制，為糖尿病治療提供思路，同時(shí)為相關(guān)藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡的 C57BL/6J小鼠10只，♂，體質(zhì)量(18±2) g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004；6 周齡 TRPC5-/-(TRPC5基因敲除)小鼠，種鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行繁殖，通過(guò)基因分型篩選出純合子用于實(shí)驗(yàn)。小鼠均飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，保持光照/黑暗各12 h，恒定循環(huán)。環(huán)境溫度25 ℃，濕度0.40～0.60。

1.2 藥物與試劑己糖激酶(HK)測(cè)試盒(批號(hào)：A077-1)、果糖磷酸激酶(PFK)活性測(cè)定試劑盒(批號(hào)：A129-1-1)、丙酮酸激酶(PK)測(cè)試盒(批號(hào)：A076-1)、丙酮酸(PA)測(cè)試盒(批號(hào)：A081)、總膽固醇(TC)測(cè)試盒(批號(hào)：A111-1-1)、甘油三酯(TG)測(cè)試盒(批號(hào)：A110-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)試盒(批號(hào)：A113-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)試盒(批號(hào)：A112-1)、檸檬酸合成酶(CS)測(cè)試盒(批號(hào)：A108)、小鼠乙酰輔酶A羧化酶(ACC)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：H232)、小鼠脂肪酸合成酶(FAS)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：H231)、游離脂肪酸(NEFA)測(cè)試盒(批號(hào)：A042)、糖原測(cè)試盒(批號(hào)：A043-1-1)，以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠insulin ELISA試劑盒(批號(hào):Cat No.EM017)購(gòu)自依科賽生物科技(太倉(cāng))有限公司。

1.3 儀器高速離心機(jī)(5417R, Eppendorf)，酶標(biāo)儀(MultiskanGo，Thermo)，微量加樣器(Eppendorf)，HW-1000 超級(jí)恒溫水浴(成都泰盟科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組C57BL/6J小鼠與TRPC5-/-小鼠各10只，均隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5)和高糖組(n=5)，對(duì)照組給予正常飲水，高糖組給予質(zhì)量濃度為100 g·L-1的糖水各8周。

1.5 小鼠體重及空腹血糖測(cè)定稱(chēng)重，剪尾，從尾靜脈采集空腹全血，檢測(cè)空腹血糖(FBG)。此后，連續(xù)8周，每周固定時(shí)間進(jìn)行稱(chēng)重，同時(shí)檢測(cè)空腹血糖。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)小鼠喂養(yǎng)8周，最后一次檢測(cè)體重及空腹血糖后，眼球摘除取血，分離血清，并檢測(cè)血清中Insulin、HK、PFK、PK、PA、TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量；同時(shí)取小鼠肝臟組織，稱(chēng)重，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于檢測(cè)肝臟中上述生化指標(biāo)以及CS、ACC、FAS、NEFA、肝糖原含量。同時(shí)取小鼠皮下脂肪組織，用于檢測(cè)FAS和NEFA含量。

1.7 RNA-sequence

1.7.1樣品收集與測(cè)序 8周后，取小鼠肝臟組織，提取RNA，并檢測(cè)其純度及完整性。達(dá)到建庫(kù)要求后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，稀釋文庫(kù)至105 mg·L-1，并使用 Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的 insert size 進(jìn)行檢測(cè)。insert size 達(dá)到預(yù)期后，通過(guò)Q-PCR 對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度高于 2 nmol·L-1)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling，而后進(jìn)行 Illumina 測(cè)序，得到待測(cè)片段序列(該過(guò)程委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行)。

1.7.2數(shù)據(jù)分析 將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，序列比對(duì)到參考基因。對(duì)基因表達(dá)水平定量，數(shù)據(jù)整理后使用R語(yǔ)言軟件中edge R 包進(jìn)行差異基因分析，以校正后的P值<0.01以及 |log2foldchange|>2作為顯著差異表達(dá)的閾值進(jìn)行過(guò)濾，篩選得到各組間的差異基因。然后利用clusterProfiler進(jìn)行GO功能分析，注釋其參與的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，使用Omicshare進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集，然后使用Cytoscape中的CytoHubba進(jìn)行差異基因核心分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重與空腹血糖各組小鼠體重隨著時(shí)間增加逐漸增重，且TRPC5-/-組小鼠的體重一直高于C57BL/6J小鼠，且兩組間體重差異具有顯著性(P<0.05)； TRPC5-/-小鼠空腹血糖一直低于C57BL/6J小鼠，兩組間血糖差異具有顯著性(P<0.05)，提示TRPC5基因與體重、血糖的變化相關(guān)。

高糖組在給予糖水1周后，兩組體重?zé)o明顯差異；2周后，C57BL/6J小鼠組體重高于TRPC5-/-小鼠組(P<0.05)；且給予糖水1月后，TRPC5-/-小鼠與C57BL/6J小鼠的空腹血糖差異無(wú)顯著性，見(jiàn)Fig 1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TRPC5基因影響糖代謝過(guò)程。

Fig 1 Changes of weight and fasting blood sucrose in *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2.1小鼠血清中胰島素含量 各組小鼠飼養(yǎng)8周后，分別取血清，測(cè)定血清中胰島素含量。結(jié)果顯示對(duì)照組C57BL/6J小鼠血清中胰島素含量高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；而給予糖水8周之后，C57BL/6J小鼠血清中胰島素含量低于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)。這提示正常情況下，敲除TRPC5基因，胰島素分泌減少；但在高糖刺激下，敲除TRPC5基因反而促進(jìn)胰島素分泌。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Insulin content in serum of *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

2.2.2小鼠血清中糖脂相關(guān)指標(biāo) 檢測(cè)結(jié)果顯示，各組血清中，C57BL/6J小鼠PK和HDL-C含量均高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；而PA、TG、TC含量均低于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；兩種小鼠間PFK、HK和LDL-C含量差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)Fig 3。提示TRPC5基因影響糖代謝過(guò)程及血脂水平。

Fig 3 Determination results of (A) HK, PK, PA, FPK; (B) TC,TG, HDL-C, LDL-Cin mouse serum *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

給予高糖刺激后，兩種小鼠的PK、PA、TG以及LDL-C含量均有所下降，且兩種小鼠間以上各指標(biāo)含量趨于差異無(wú)顯著性(P>0.05)；此外，兩種小鼠在高糖刺激下，TC含量均明顯升高，且C57BL/6J小鼠升高快于TRPC5-/-小鼠，直至8周后C57BL/6J小鼠TC含量明顯高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；值得注意的是，TRPC5-/-小鼠的PFK含量增高，且明顯高于C57BL/6J組(P<0.05)，提示TRPC5基因能抑制糖酵解；兩種小鼠在高糖刺激下HK含量無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)Fig 3。以上結(jié)果提示，給予高糖刺激后，一部分糖進(jìn)入糖酵解過(guò)程，一部分糖轉(zhuǎn)化為了脂類(lèi)中的膽固醇，該過(guò)程中TRPC5基因可以在一定程度上抑制糖酵解，促進(jìn)膽固醇的合成。

2.2.3小鼠肝臟中糖脂相關(guān)指標(biāo) 對(duì)照組中，C57BL/6J小鼠的臟器指數(shù)高于TRPC5-/-小鼠，其肝臟中PK、PA、NEFA含量均低于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)；二者間TC、LDL-C和HDL-C含量差異無(wú)顯著性(P>0.05)；C57BL/6J小鼠TG與肝糖原含量高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05)。

高糖刺激后，二者HDL-C和肝糖原含量增高，且C57BL/6J小鼠明顯高于TRPC5-/-小鼠(P<0.05,P<0.01)；但TRPC5-/-小鼠ACC含量明顯高于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Determination results of (A) liver wet / weight(B) HK, PK, PFK, CS; (C) TC, TG,HDL-C, LDL-C；(D) PA, NEFA; (E) ACC, FAS; (F) Glycogen in *P<0.05 vs C57BL/6J;#P<0.05,##P<0.01 vs C57BL/6J(Sucrose).

2.2.4小鼠皮下脂肪中相關(guān)指標(biāo) 結(jié)果顯示，對(duì)照組TRPC5-/-小鼠FAS與NEFA含量均高于C57BL/6J小鼠(P<0.05),見(jiàn)Fig 5。

高糖刺激后，兩組小鼠的FAS含量有所增高，但C57BL/6J小鼠組增高大于TRPC5-/-小鼠，直至8周后兩組小鼠間FAS含量差異無(wú)顯著性(P>0.05)；同時(shí)，C57BL/6J小鼠NEFA含量有所上升，8周后兩組小鼠之間差異無(wú)顯著性(P>0.05),見(jiàn)Fig 5，提示高糖刺激下TRPC5基因促進(jìn)該部位脂肪酸合成，進(jìn)而促進(jìn)皮下脂肪合成。

2.3 小鼠肝臟組織RNA-sequence

Fig 5 Determination of FAS and NEFA in subcutaneous *P<0.05 #P<0.05 vs C57BL/6J (Sucrose).

2.3.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與 De nove 組裝 對(duì)各組小鼠肝臟組織中提取的總RNA分別測(cè)序得到原始圖像數(shù)據(jù)，經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為原始序列數(shù)據(jù)(raw reads)，而后組裝并去冗余，得到過(guò)濾后序列數(shù)據(jù) clean reads,見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Summary of sequences analysis

2.3.2差異表達(dá)分析 對(duì)照組中，與C57BL/6J組相比較，TRPC5-/-組共檢測(cè)到674個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)差異基因(紅色) 347個(gè)，下調(diào)差異基因(綠色)327個(gè)。高糖組中，與C57BL/6J組比，TRPC5-/-組共檢測(cè)到差異基因1 022個(gè)，其中上調(diào)基因663個(gè)，下調(diào)基因359個(gè)。高糖組上調(diào)基因數(shù)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)，提示在高糖刺激下，TRPC5基因會(huì)影響其它相關(guān)基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡，差異基因火山圖見(jiàn)Fig 6。

Fig 6 Volcano map of differentially expressed genes

2.3.3差異表達(dá)基因GO功能分析 選取差異基因富集數(shù)目占前10的內(nèi)容(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組在生物學(xué)過(guò)程中，較多的差異基因歸類(lèi)為細(xì)胞趨化性、有機(jī)酸生物合成及脂質(zhì)定位；在細(xì)胞組成中，歸類(lèi)為膜筏、膜區(qū)以及血漿脂蛋白顆粒；在分子功能中，參與氧化還原酶、氧氣及血紅素結(jié)合的差異基因較多，見(jiàn)Fig 7。

Fig 7 Go function analysis of normal miceA:BP;B:CC;C:MF

高糖組在生物學(xué)過(guò)程中，較多的差異基因歸類(lèi)為嘌呤核苷酸代謝過(guò)程、氧化應(yīng)反應(yīng)及脂肪酸代謝過(guò)程；在細(xì)胞組成中，歸類(lèi)為線粒體內(nèi)膜的差異基因最多；在分子功能中，較多的差異基因歸類(lèi)為核苷結(jié)合、小GTPase結(jié)合(P<0.05)，見(jiàn)Fig 8。

本結(jié)果證明，敲除TRPC5基因之后，對(duì)免疫及脂質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程有影響；高糖刺激下，影響則主要集中在核苷酸代謝及脂肪酸的代謝過(guò)程，提示TRPC5基因在糖脂代謝中扮演重要角色。

2.3.4差異表達(dá)基因KEGG功能分析 我們選取了差異基因富集數(shù)目較多的前10條通路(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組中，差異表達(dá)基因較多的富集在吞噬體、視黃醇代謝通路；給予高糖刺激后，則較多的富集在代謝通路、產(chǎn)熱、內(nèi)分泌抵抗過(guò)程中，見(jiàn)Fig 9。提示TRPC5基因在糖代謝及產(chǎn)熱過(guò)程中有重要作用。

Fig 9 Result of KEGG signaling pathwayA:Control;B:Sucrose

2.3.5差異表達(dá)基因關(guān)鍵基因篩選 通過(guò)使用Cytoscape中的CytoHuba插件可視化分析并計(jì)算出前100的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)高糖刺激后，TRPC5基因核心排序從48位變?yōu)榱?6位，再次證明TRPC5基因影響糖脂轉(zhuǎn)換，是潛在的糖尿病治療靶標(biāo)。

3 討論

研究表明，代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)和胰島素抵抗在T2DM和心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用[11]。代謝綜合征是人體的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂的病理狀態(tài)，是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，同時(shí)也是導(dǎo)致糖尿病心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。有研究證實(shí)非選擇性的陽(yáng)離子通道-瞬時(shí)受體電位通道(TRPCs)與代謝綜合征的病理生理機(jī)制相關(guān)[12]，TRPC1、TRPC3、TRPC6三種亞型被敲除或者抑制后均可顯著降低血糖[13]；且TRPC5與糖酵解有關(guān)，在化療耐藥治療中扮演重要角色[14]。本研究中，在高糖刺激后，TRPC5基因可以一定程度抑制糖酵解，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了TRPC5基因與糖酵解的相關(guān)性，也為耐藥機(jī)制的研究提供了思路。

本研究前期結(jié)果中，敲除TRPC5基因，對(duì)小鼠體重及血糖均有影響，推測(cè)TRPC5基因與肥胖及糖尿病可能有聯(lián)系。我們通過(guò)給予小鼠高糖刺激，進(jìn)一步對(duì)這一推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在高糖刺激下，與C57BL/6J小鼠相比，TRPC5-/-小鼠胰島素分泌增加，TC含量減少，提示對(duì)于1型糖尿病患者，抑制其TRPC5基因可能會(huì)對(duì)其癥狀有所緩解；且高糖刺激下抑制TRPC5基因可使PFK含量增加，促進(jìn)糖酵解，同時(shí)肝臟中ACC含量增加，促進(jìn)脂肪酸合成，影響脂代謝過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控糖脂代謝過(guò)程。有研究報(bào)道，血脂代謝調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)在糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有影響[3,15]，本研究為了再次明確TRPC5在糖脂代謝中的重要作用，使用RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)肝臟組織進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除TRPC5基因后，在高糖刺激下會(huì)影響體內(nèi)其它基因上調(diào)，從而在糖脂代謝中起到作用。治療糖尿病的藥物二甲雙胍也是通過(guò)調(diào)節(jié)多種代謝通路來(lái)達(dá)到降血糖效果的[15]，若能明確TRPC5的作用，則有助于研發(fā)新的通過(guò)調(diào)節(jié)代謝通路來(lái)治療糖尿病的藥物。

本文針對(duì)TRPC5在糖脂代謝中的影響進(jìn)行了研究，為T(mén)RPC5成為治療糖尿病及其他代謝類(lèi)疾病的潛在靶標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有關(guān)其發(fā)揮作用的詳細(xì)分子機(jī)制及信號(hào)通路尚需進(jìn)一步研究探討。