林海燕，王珊珊，馬玉潔，呂世偉，周德慶

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島266071；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

南極磷蝦（Euphausia superba）生物儲量大，對維持整個南極海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡起著重要作用[1]。據(jù)估計目前全球每年南極磷蝦捕撈量近30萬噸，主要用來制作魚餌和飼料等低值化產(chǎn)品及蝦油軟膠囊等產(chǎn)品，大量富含優(yōu)質(zhì)蛋白的副產(chǎn)物未得到有效利用，造成資源的浪費。南極磷蝦蛋白中含有18種常見氨基酸，其中包括 8種人體必需氨基酸（essential amino acids，EAA）[2]，構成比例符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織 （Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的理想蛋白質(zhì)模式[3]。目前對南極磷蝦蛋白的研究主要集中在磷蝦活性多肽的制備和功效研究等方面，為南極磷蝦蛋白的高值化開發(fā)利用提供了有效途徑。

鐵作為機體必需的微量元素，對促進機體生長發(fā)育、新陳代謝等方面具有重要的生理功效[4]。鐵元素主要參與機體氧的運輸和儲存、細胞色素及某些金屬酶的合成、能量的生產(chǎn)和細胞的增殖等多種生化過程[5]。鐵缺乏可導致細胞低色素貧血、成人機體活動障礙及兒童認知障礙等風險[6]。目前，由于機體對鐵的攝入量較少、吸收率過低等原因，缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA）已成為世界各國普遍關注的營養(yǎng)性疾病之一。市場上存在的鐵補充劑主要是硫酸亞鐵等無機鐵補充劑，以及琥珀酸亞鐵、富馬酸亞鐵、乳酸亞鐵等可溶性的小分子有機鐵鹽絡合物[7]。然而這些補鐵劑存在穩(wěn)定性差、機體生物利用率低等問題，若長期服用還可能對腸胃產(chǎn)生刺激，嚴重時可導致機體出現(xiàn)惡心嘔吐的癥狀及鐵中毒等風險[8]。肽-亞鐵螯合物作為新型食源性鐵補充劑，具有安全性好、穩(wěn)定性佳、生物利用率高等優(yōu)點，是當前食品領域中極具發(fā)展?jié)摿Φ墓δ芤蜃印１疚囊阅蠘O磷蝦肽（antarctic krill iron-chelating peptides，AKP）和 FeCl2·4H2O為原料，以亞鐵螯合率和螯合物得率為評價指標，在單因素試驗基礎上采用正交試驗制備南極磷蝦肽-亞鐵螯合物（antarctic krill peptide-ferrous chelates，AKP-Fe），并對其理化性質(zhì)進行分析，以期為南極磷蝦蛋白的高值化利用和新型補鐵劑的開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦：遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司；FeCl2·4H2O、FeSO4、鄰菲啰啉、鹽酸羥胺、茚三酮、D-果糖、無水乙醇、抗壞血酸、Na2S、NaOH、HCl（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

XT5118-OV50電熱鼓風干燥箱：杭州雪中炭恒溫技術有限公司；UV-9000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝股份有限公司；STARTER 3C pH計：奧豪斯儀器有限公司；HH-21-4電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；LC-4012離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；Bruker Tensor 27紅外光譜儀：德國Bruker公司；JSM-840型掃描電鏡：日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 AKP-Fe的制備

1）AKP的制備：南極磷蝦原料→預處理→勻漿→酶解→滅酶→離心→冷凍干燥→AKP樣品[9]。

2）AKP-Fe的制備：AKP→溶解→加入抗壞血酸→調(diào)節(jié)pH值→加入FeCl2·4H2O→恒溫水浴螯合反應→離心→取上清液→無水乙醇沉淀→沉淀→真空冷凍干燥→AKP-Fe樣品[10]。

3）操作步驟：稱取3 g AKP放入燒杯中，加入100 mL蒸餾水使其充分溶解，得到濃度為30 mg/mL樣品溶液，并加入抗壞血酸防止Fe2+氧化，調(diào)節(jié)反應體系的pH值。然后按比例加入FeCl2·4H2O，在35℃反應30 min，冷卻后將反應液在4 500 r/min的條件下離心15 min。取上清液用6倍體積無水乙醇反復洗滌多次后收集沉淀，將沉淀物冷凍干燥后得到AKP-Fe。

1.3.2 亞鐵螯合率與螯合物得率的測定

參照李博等[10]和蔡冰娜等[11]的測定方法，并略作修改。

1）鐵離子標準溶液（10 μg/mL）的配制：精確稱取0.7022gFe（NH4）2（SO4）2·6H2O溶解于20mL6mol/LHCl和少量超純水中，定容至1 L，得到濃度為100 μg/mL Fe2+溶液。從上述溶液中移取10 mL，加入2 mL 6 mol/L HCl溶液，定容至100 mL，配制成10 μg/mL的鐵離子標準溶液，避光保存。

2） 標準曲線的繪制：分別吸取 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL的標準溶液于50 mL容量瓶中，然后依次加入1 mol/L HCl溶液、10%鹽酸羥胺溶液、0.12%鄰菲啰啉溶液各1mL、10%醋酸鈉溶液5mL，定容后于510nm處測定吸光度。參比液為不含鐵離子的溶液，橫坐標為鐵含量，縱坐標為吸光值。

3）樣品測定：準確稱取一定量的樣品溶解于含有2mL濃鹽酸的超純水中，定容至100mL。吸取一定體積的樣品溶液于50mL容量瓶中，按標準曲線測定方法測定樣品中鐵含量。每個樣品重復3次試驗，取平均值。

式中：m1為螯合物中亞鐵含量，mg；m2為加入體系的鐵含量，mg，W1為 AKP-Fe 的質(zhì)量，mg；W2為AKP 與 FeCl2·4H2O 的總量，mg。

1.3.3 抗壞血酸添加量對螯合反應的影響

固定AKP的濃度為3%，AKP與FeCl2·4H2O的質(zhì)量比為3∶1，選用抗壞血酸與FeCl2·4H2O的質(zhì)量比為（0、0.1 ∶1、0.2 ∶1、0.3 ∶1、0.4∶1、0.5∶1）。將反應體系的pH值調(diào)整為5，置于35℃的水浴鍋中螯合反應30 min取出，冷卻后將反應液在8 000 r/min的條件下離心10 min，烘干并比較沉淀的質(zhì)量。

1.3.4 單因素試驗

分別固定AKP的濃度為3%，肽與FeCl2·4H2O的質(zhì)量比為3∶1，螯合溫度35℃，螯合時間30 min，pH值為5，乙醇體積倍數(shù)為6，抗壞血酸與FeCl2·4H2O質(zhì)量比為0.2∶1，以亞鐵螯合率和亞鐵螯合物得率為測定指標，進一步探究螯合溫度（25、35、45、55、65℃）、螯合時間（20、30、40、50、60、70 min）、AKP 的濃度（2%、3%、4%、5%、6%）、pH 值（3、4、5、6、7）、AKP 與FeCl2·4H2O 的質(zhì)量比（1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1）對螯合反應的影響。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇對評價指標影響較大的3個因素（肽鐵質(zhì)量比、螯合溫度、pH值）進行正交試驗，確定最佳螯合工藝參數(shù)。正交試驗因素與水平的設計如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜掃描

將烘干至恒重的KBr分別與適量的AKP與AKP-Fe凍干粉充分混合、研磨并壓片，在波長為4 000 cm-1～400 cm-1的范圍內(nèi)對其進行掃描[10]。

1.3.7 掃描電鏡及能譜分析

取適量的AKP與AKP-Fe樣品，經(jīng)真空噴金處理后，在掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察樣品的顯微結構，并利用能譜儀（electron energy disperse spectroscopy，EDS）分析元素成分及含量[2]。

1.3.8 氨基酸組成分析

參考GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[12]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 抗壞血酸添加量對螯合反應的影響

研究表明，在中性或偏堿性的環(huán)境中，F(xiàn)e2+較Fe3+的溶解性高，且Fe2+有利于機體的吸收利用。由于Fe2+在空氣或溶液中極易被氧化成Fe3+，生成氫氧化鐵沉淀[13-14]，造成螯合物不純。因此為制備純度較高的亞鐵螯合物，抗氧化劑的選擇和使用十分關鍵。楊華等[15]制備大豆多肽-亞鐵螯合物時，比較了亞硫酸氫鈉、鹽酸羥胺、抗壞血酸、異抗壞血酸鈉等抗氧化劑對反應體系中Fe2+的保護效果，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸的效果最佳。圖1為抗壞血酸與FeCl2·4H2O質(zhì)量比對螯合反應的影響。

圖1 抗壞血酸與FeCl2·4H2O質(zhì)量比對螯合反應的影響Fig.1 Effect of the mass ratio of ascorbic acid and FeCl2·4H2O on chelating reaction

由圖1可以看出，在試驗所選范圍內(nèi)，沉淀的質(zhì)量隨抗壞血酸與FeCl2·4H2O的質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢。當兩者質(zhì)量比為0.2∶1時，生成的沉淀質(zhì)量最低，且抗壞血酸的添加也不會破壞整個反應體系。因此選擇抗壞血酸與FeCl2·4H2O的質(zhì)量比為0.2∶1。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 肽濃度對螯合反應的影響

AKP濃度對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響見圖2。

圖2 AKP濃度對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響Fig.2 Effect of peptide concentration on iron-chelating rate and chelate yield

由圖2可知，在螯合反應過程中，亞鐵螯合率和螯合物得率均隨AKP濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當AKP濃度在2%～5%時，亞鐵螯合率和螯合物得率均呈現(xiàn)增加趨勢；當肽濃度高于5%時，兩個指標則呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于AKP濃度較低時，反應體系中肽鏈與Fe2+之間的相互碰撞較少，導致螯合率和產(chǎn)物得率相對偏低[16]。當AKP濃度過高時，反應體系中存在的大量產(chǎn)物可能會使螯合反應呈逆向進行，同樣不利螯合反應的進行。因此選擇AKP濃度為4%。

2.2.2 肽鐵質(zhì)量比對螯合反應的影響

肽鐵質(zhì)量比對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響見圖3。

圖3 肽鐵質(zhì)量比對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響Fig.3 Effect of mass ratio of peptide to iron on iron-chelating rate and chelate yield

圖3表明，隨肽鐵質(zhì)量比的增加，螯合物得率和亞鐵螯合率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當肽鐵質(zhì)量比較低時，反應體系中存在過多的Fe2+未能螯合，致使亞鐵螯合率和螯合物得率偏低。當肽鐵質(zhì)量比過高時，反應體系中則剩余部分肽鏈，不僅導致螯合物的純度降低，還會造成多肽資源的浪費。當肽鐵質(zhì)量比為3∶1時，兩指標均達到最高值，因此選擇肽鐵質(zhì)量比為3∶1。

2.2.3 溫度對螯合反應的影響

溫度對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響見圖4。

圖4 溫度對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響Fig.4 Effect of temperature on iron-chelating rate and chelate yield

由圖4可知，當螯合溫度為35℃時，亞鐵螯合率和螯合物得率最高，其中亞鐵螯合率可達77.31%。當反應體系溫度過低時，肽鏈與Fe2+的反應活力降低，分子間的碰撞幾率減小，致使螯合反應進行緩慢。當反應體系溫度過高時，則可能導致Fe2+的氧化，致使產(chǎn)物不純，從而降低螯合率和螯合物得率[8]。因此選擇螯合溫度為35℃。

2.2.4 時間對螯合反應的影響

時間對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響見圖5。

圖5 時間對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響Fig.5 Effect of time on iron-chelating rate and chelate yield

由圖5可知，隨著螯合時間的延長，螯合物得率和亞鐵螯合率均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。這可能是因為AKP與Fe2+可以在短時間內(nèi)完成螯合，生成大量的螯合物；但隨著時間的延長，AKP與螯合物均有不同程度的水解，導致螯合率和螯合物得率降低[17]。因此選擇反應時間為40 min。

2.2.5 pH值對螯合反應的影響

pH值對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響見圖6。

圖6 pH值對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響Fig.6 Effect of pH on iron-chelating rate and chelate yield

由圖6可知，pH值對亞鐵螯合率和螯合物得率的影響較大。在pH值較低的酸性條件下，溶液中含有大量的H+，與Fe2+競爭供電基團，從而不利于產(chǎn)物的生成，導致亞鐵螯合率下降。隨著pH值的增大，產(chǎn)物得率和亞鐵螯合率呈上升趨勢，當pH值為6時，達到最大值。當pH值繼續(xù)升高時，由于溶液中OH-含量增多，可與Fe2+結合生成氫氧化物沉淀[15-16]，致使產(chǎn)物不純。因此選擇反應體系pH值為6。

2.3 正交試驗結果分析

綜合單因素試驗結果，固定肽濃度為4%，螯合時間為40 min，乙醇體積倍數(shù)為6，選取A肽鐵質(zhì)量比、B螯合溫度、C pH值3個因素為自變量，以亞鐵螯合率和螯合物得率為評價指標，采用正交試驗對螯合工藝進行優(yōu)化，試驗設計方案和結果如表2所示。

表2 正交試驗設計方案與結果Table 2 Experimental design scheme with experimental results for orthogonal test

通過極差分析方法比較肽鐵質(zhì)量比、螯合溫度、pH值3個因素對AKP-Fe制備的影響。由表2可知，肽鐵質(zhì)量比對亞鐵螯合率的影響最大，溫度次之，pH值影響最小，即A>B>C，得到以亞鐵螯合率為指標的最優(yōu)工藝組合為A2B3C3；溫度對螯合物得率的影響最大，肽鐵質(zhì)量比的影響次之，pH值影響最小，即B>A>C，得到以螯合物得率為指標的最優(yōu)工藝組合為A2B3C1；結合單因素試驗結果，pH值較高時反應產(chǎn)生的沉淀相對較多，因此制備AKP-Fe的最佳工藝條件為：肽鐵質(zhì)量比3∶1，螯合溫度40℃，螯合時間40min，pH值5.5，肽濃度4%，乙醇體積倍數(shù)6。經(jīng)驗證，此條件下測得亞鐵螯合率為（77.25±2.11）%，螯合物得率為（41.03±0.68）%。

2.4 紅外光譜分析

AKP與AKP-Fe的紅外光譜圖見圖7。

如圖7所示，AKP在3 341.79 cm-1處出現(xiàn)的酰胺A吸收峰，主要是由酰胺結構中N-H伸縮振動所產(chǎn)生；AKP在1 663.30 cm-1處出現(xiàn)的酰胺I強吸收峰，主要是由于C=O伸縮振動所產(chǎn)生；AKP在1 397.42 cm-1處出現(xiàn)的酰胺II吸收峰較弱，主要是由氨基酸殘基側鏈基團中COO-引起的；AKP在959.17 cm-1處的弱吸收峰主要是由NH4+引起[17]。與AKP譜圖相比，經(jīng)螯合后的AKP-Fe特征吸收峰發(fā)生了變化。AKP-Fe的酰胺A吸收峰由3 341.79 cm-1處移至3 355.29 cm-1處，酰胺I吸收峰由1 663.30 cm-1處移至1 654.62 cm-1處，而在959.17 cm-1處的銨鹽吸收峰消失。由AKP-Fe酰胺A帶藍移、酰胺I帶紅移、銨鹽吸收峰消失等特征，初步說明AKP中的氨基及羧基與Fe2+發(fā)生了螯合反應形成肽亞鐵螯合物[16]。

圖7 AKP與AKP-Fe的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of AKP and AKP-Fe

2.5 掃描電鏡及能譜分析

AKP及AKP-Fe的SEM圖譜見圖8。

圖8 AKP及AKP-Fe的SEM圖譜Fig.8 Scannig electron micrographs of AKP and AKP-Fe

從圖 8（A1～A3）可知，AKP 表面平滑，結構緊密、均勻，多為大小不一的片狀，與Chen等[18]制備羅非魚皮多肽的顯微結構較為相似。由圖8（B1～B3）可知，螯合反應導致產(chǎn)物顯微結構發(fā)生明顯變化，AKP-Fe呈現(xiàn)出較為致密的顆粒狀聚集體結構，顆粒直徑約為100 nm～200 nm。張凱等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)鱈魚骨明膠多肽與Ca2+螯合后，螯合物為直徑10 μm左右的光滑球狀顆粒結構。韓克光等[21]研究發(fā)現(xiàn)羊骨明膠多肽與Ca2+螯合之后，多肽也由零散的片狀結構變?yōu)檩^為緊密的顆粒狀聚集體，與本研究的結果較為一致。

分別對圖8中AKP及AKP-Fe的視野進行能譜分析，結果如表3所示。

表3 各元素質(zhì)量百分比Table 3 Chemical equivalent percentages of each element %

由圖8和表3可知，AKP中的主要元素分別為C、N、O等，這些元素的含量占總元素的98.43%；AKP-Fe中的主要元素分別為C、N、O、Fe等，其中鐵元素含量為20.71%，表明在螯合物制備過程中，大量Fe2+與AKP發(fā)生了螯合。

2.6 氨基酸組成分析

對AKP-Fe進行氨基酸組成分析，結果如表4所示。

AKP-Fe中含有常見的18種氨基酸，氨基酸種類齊全、含量豐富，其中Glu含量最高為18.24 g/100 g，Asp次之、含量為11.21 g/100 g，Lys與Arg的含量也相對較高，分別為 4.84 g/100 g 和 3.36 g/100 g，而 Thr、Trp、Pro、Tyr、Cys的含量相對較少。Wu 等與 Perrin 等[22-23]的研究表明，Glu和Asp因其具有環(huán)狀結構能夠與鐵離子形成穩(wěn)定的螯合物，是形成螯合物的關鍵氨基酸。AKP-Fe中的Glu和Asp含量較高，有可能在螯合反應中發(fā)揮了重要作用。

表4 氨基酸組成分析Table 4 Analysis of amino acid composition g/100 g

續(xù)表4 氨基酸組成分析Continue table 4 Analysis of amino acid composition g/100 g

3 結論

本研究以AKP和FeCl2·4H2O為原料，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優(yōu)化出AKP-Fe的制備條件為：肽鐵質(zhì)量比3∶1，螯合溫度40℃，螯合時間40 min，pH值5.5，肽濃度4%，乙醇體積倍數(shù)6。此條件下測得亞鐵螯合率為（77.25±2.11）%，螯合物得率為（41.03±0.68）%。FTIR分析顯示Fe2+與AKP螯合后，AKP-Fe酰胺A吸收峰發(fā)生藍移、酰胺I吸收峰發(fā)生紅移、銨鹽吸收峰消失。掃描電鏡顯示螯合后產(chǎn)物結構發(fā)生顯著改變，AKP-Fe呈現(xiàn)出顆粒狀聚集體結構。氨基酸分析表明，AKP-Fe中的氨基酸組成種類齊全，結構合理。本研究為南極磷蝦蛋白的高值化開發(fā)利用和新型補鐵劑的開發(fā)提供了理論支持。