閆旭宇，李娟，任潘，李玲

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西延安716000）

銀杏（GinkgobilobaL.）為銀杏科銀杏屬植物，銀杏葉是銀杏樹的干燥葉，具有平喘、斂肺、活血化瘀、止痛等作用，在治療炎癥、血栓、高血脂癥和心血管病方面應(yīng)用廣泛[1-2]。銀杏葉化學(xué)成分復(fù)雜，種類繁多，其主要活性成分是黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類化合物[2-3]。多酚類化合物包括黃酮類、酚酸類、單寧類及花色苷類等[4]，廣泛存在于植物的根、莖、葉，以及部分果實(shí)中，具有重要的生理活性和一定的保健作用。多酚類化合物分子結(jié)構(gòu)中有很多的鄰位酚羥基，捕獲活性氧等自由基的能力較強(qiáng)[5]，有抗炎抗菌、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗突變等多種生理和藥理活性，可作為一種天然安全有效抗氧化劑來源[4，6-7]。

近年來，多酚的提取研究非常廣泛，主要集中在壇紫菜[8-11]、天胡荽、龍爪稷、藜麥等植物、祁白術(shù)[12]等藥材、以及各種水果和堅(jiān)果[13-15]；銀杏外種皮、果殼、葉片等常用來提取多酚，但在葉片中多酚含量較高[4，8，16-17]。多酚提取方法主要利用醇提法[4，17]，以及在醇提法基礎(chǔ)上輔助以酶法、超聲波、微波等手段來增強(qiáng)提取效果[8]，雖然超聲波輔助提取效果略低于酶法，但優(yōu)于微波法[8]。

過量的羥自由基會(huì)干擾機(jī)體正常的新陳代謝，引起DNA、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子的氧化損傷，破壞正常細(xì)胞和組織，加速機(jī)體衰老，進(jìn)而誘發(fā)心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病及其并發(fā)癥[16，18-19]。隨著現(xiàn)代方便食品中抗氧化劑、防腐劑等添加劑的增多，體內(nèi)原有的內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)負(fù)荷日益增大，服用天然安全的外源性自由基清除劑來減輕過量自由基的損害，對(duì)于保持體內(nèi)自由基平衡、維持身體健康是很有必要的[16]。同時(shí)，食品常用抗氧化劑如特丁基對(duì)苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）和二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）等屬于人工合成抗氧化劑，由于其具有一定的毒性，許多國家已經(jīng)停止或嚴(yán)格限制其使用，尋找并開發(fā)利用安全有效的天然抗氧化劑已經(jīng)引起廣泛重視[18]。研究表明，銀杏多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)羥自由基的清除效果較好[4，16]。因此，本研究以銀杏葉為材料，以多酚提取率為指標(biāo)，利用超聲輔助乙醇提取銀杏葉多酚，用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化銀杏葉多酚的提取工藝條件，并初步研究多酚對(duì)羥自由基的清除作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用銀杏葉資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

銀杏葉：2018年7月采自延安大學(xué)校園內(nèi)，新鮮、健康、無病蟲害。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；其余均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)、AUX220型分析天平：日本島津公司；KQ500B型超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司；FW-100D型植物粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；WG-71型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏葉多酚的提取工藝流程

銀杏葉→清洗→烘干→粉碎→過篩→乙醇提取→過濾→濃縮→提取液

1.2.2 多酚含量的測(cè)定

銀杏葉多酚的含量按文獻(xiàn)[9]采用福林酚法，在波長765 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.082 5X+0.020 6（R2=0.998 2）。銀杏葉多酚的提取率計(jì)算公式如下：

式中：E為銀杏葉多酚提取率，%；m為銀杏葉質(zhì)量，g；v為提取液體積，mL；b 為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，在恒定超聲功率（350 W）條件下，研究乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響，確定超聲輔助提取銀杏葉多酚的最適工藝參數(shù)范圍。

1.2.3.1 乙醇濃度的選擇

準(zhǔn)確稱取1.0 g干燥的銀杏葉粉末5份，分別加入25 mL濃度為60%、65%、70%、75%、80%的乙醇，在60℃的條件下超聲回流30 min，研究乙醇濃度對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響。

1.2.3.2 料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取1.0 g干燥的銀杏葉粉末5份，分別加入15、20、25、30、35 mL 濃度為 70%的乙醇，在 60℃的條件下超聲回流30 min，研究料液比對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響。

1.2.3.3 提取溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取1.0 g干燥的銀杏葉粉末5份，分別加入25 mL 濃度為 70%的乙醇，分別在 50、55、60、65、70 ℃的條件下超聲回流30 min，研究提取溫度對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響。

1.2.3.4 超聲時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱取1.0 g干燥的銀杏葉粉末5份，分別加入25 mL濃度為70%的乙醇，在60℃的條件下超聲回流20、25、30、35、40 min，研究超聲時(shí)間對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多酚提取率為響應(yīng)值，對(duì)影響多酚提取率的乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定超聲輔助提取銀杏葉多酚的最佳工藝條件。

1.2.5 銀杏葉多酚清除羥自由基試驗(yàn)

銀杏葉多酚及VC對(duì)羥基自由基的清除率，采用水楊酸法[18]進(jìn)行測(cè)定。羥基自由基的清除率計(jì)算公式如下：

式中：E為羥基自由基清除率，%；A0為空白對(duì)照液的吸光值；Am為加入多酚后的吸光值；An為不加H2O2時(shí)多酚的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇濃度的確定

不同乙醇濃度下多酚的提取率見圖1。

圖1 不同乙醇濃度下多酚的提取率Fig.1 The extraction rate of polyphenols under different ethanol concentrations

如圖1可知，隨著乙醇濃度的提高，銀杏葉多酚提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度超過70%后，多酚提取率增加較為緩慢，在75%時(shí)達(dá)到最高，之后繼續(xù)提高乙醇濃度，多酚提取率逐漸降低。乙醇濃度與銀杏葉多酚提取率的關(guān)系表明，適當(dāng)增大乙醇濃度會(huì)促進(jìn)多酚的溶出，而乙醇濃度過高不僅不利于多酚物質(zhì)的溶出[10]，而且增加了投料成本。考慮到提取效果及成本，最終確定乙醇的適宜濃度為70%。

2.1.2 料液比的確定

不同料液比條件下多酚的提取率見圖2。

圖2 不同料液比條件下多酚的提取率Fig.2 The extraction rate of polyphenols under different materialto-liquid ratios

由圖2可知，銀杏葉多酚提取率隨著料液比的提高呈先升后降趨勢(shì)。當(dāng)投入提取液逐漸增加直至料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值；繼續(xù)增加提取液，多酚提取率開始下降，料液比為1∶35（g/mL）時(shí)的提取率與1∶20（g/mL）時(shí)的相當(dāng)。這可能是在料液比為1∶25（g/mL）時(shí)銀杏葉多酚溶解已達(dá)到飽和，多酚已經(jīng)充分提取出來[20]；同時(shí)提取液的增加也提高了其他可溶性物質(zhì)的溶出，相對(duì)降低了多酚的比率?？紤]到提取效果及成本，料液比的適宜取值為1∶25（g/mL）。

2.1.3 提取溫度的確定

不同提取溫度下多酚的提取率見圖3。

圖3 不同提取溫度下多酚的提取率Fig.3 The extraction rate of polyphenols under different extraction temperatures

如圖3可知，提取溫度由50℃上升至60℃時(shí)，銀杏葉多酚提取率直線上升，并在60℃時(shí)提取率最大，之后繼續(xù)升高溫度，提取率逐漸緩慢下降。這可能是由于溫度較低時(shí)，多酚溶出較慢，然而當(dāng)溫度高于60℃時(shí)，不僅易使乙醇揮發(fā)，而且多酚物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)易被高溫破壞，使其穩(wěn)定性也受到一定的影響，同時(shí)雜質(zhì)溶出也會(huì)增多，使得多酚的提取效果降低[13]。故最終提取的適宜溫度為60℃。

2.1.4 超聲時(shí)間的確定

不同超聲時(shí)間下多酚提取率見圖4。

圖4 不同超聲時(shí)間下多酚的提取率Fig.4 The extraction rate of polyphenols under different ultrasonic time

如圖4可知，隨著超聲回流提取時(shí)間的延長，銀杏葉多酚提取率在30 min時(shí)增加到最大值，之后繼續(xù)延長超聲時(shí)間，多酚提取率不增反降。這可能是由于超聲回流超過一定時(shí)間，多酚的穩(wěn)定性則受到一定的影響，同時(shí)也促使銀杏葉其他物質(zhì)的溶出，使多酚含量相對(duì)下降。故控制提取時(shí)間在30 min左右時(shí)，提取效果較好。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，并結(jié)合實(shí)際投入成本與產(chǎn)出情況，以多酚提取率為響應(yīng)值，對(duì)影響銀杏葉多酚提取率的乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，各因素的水平設(shè)計(jì)見表1，優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

根據(jù)表2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元擬合回歸分析，得到以銀杏葉多酚提取率為響應(yīng)值的四元二次回歸模型方程：

Y=8.44+0.08A+0.022B+0.072C+0.081D-0.015AB+0.038AC+0.048AD-0.012BC+0.055BD+0.025CD-0.19A2-0.17B2-0.15C2-0.18D2。

由方程一次項(xiàng)可知，影響銀杏葉多酚提取率的順序依次為：超聲時(shí)間>乙醇濃度>提取溫度>料液比。為了確定各因素對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響程度并檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析[21]，結(jié)果見表 3。

表2 銀杏葉多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and experiment results of response surface methodology of polyphenols extraction rate from Ginkgo biloba leaves

由表3結(jié)果可知，模型的P＜0.000 1，極顯著，說明模型有意義；失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，說明模型與試驗(yàn)的差異值較小，決定系數(shù)R2為0.954 1，說明響應(yīng)值的變化有95.41%來源于4個(gè)試驗(yàn)因素，回歸模型擬合度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差較小，能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

回歸模型中的 PA、PC、PD、PA2、PB2、PC2、PD2值均小于0.01，PBD小于0.05，說明乙醇濃度、提取溫度和超聲時(shí)間的一次項(xiàng)、4個(gè)因素的二次項(xiàng)、以及料液比和超聲時(shí)間的交互項(xiàng)均存在顯著性，而其它因素間的交互項(xiàng)及失擬項(xiàng)顯著性相對(duì)較差。表明提取因素對(duì)響應(yīng)值多酚提取率是一種非線性關(guān)系[21-22]。由F值大小可知，超聲時(shí)間>乙醇濃度>提取溫度>料液比對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 因素間交互作用分析與條件驗(yàn)證

由方差分析可知，料液比和超聲時(shí)間之間的交互作用對(duì)銀杏葉多酚提取率影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。為更直觀形象地說明交互影響作用，利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)交互項(xiàng)作響應(yīng)曲面圖和等高線圖見圖5。響應(yīng)曲面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?；反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[21，23]。

由圖5可以看出，料液比和超聲時(shí)間相互作用的響應(yīng)面曲面坡度陡峭，等高線圖呈扁平橢圓狀，表明料液比和超聲時(shí)間之間具有較強(qiáng)的交互作用，對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響顯著。

圖5 液料比和超聲時(shí)間對(duì)銀杏葉多酚提取率的交互影響Fig.5 The interactive effect of liquid-to-material ratito and ultrasontic time on polyphenols extraction rate from Ginkgo biloba leaves

用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)一步分析回歸方程，得出銀杏葉多酚提取的最適條件為：乙醇濃度74.31%、料液比 1∶25.08（g/mL）、提取溫度 61.75℃、超聲時(shí)間30 min，預(yù)測(cè)提取率為8.386%?？紤]到實(shí)際操作的局限性，提取工藝最終修正為：乙醇濃度74%、料液比1 ∶25（g/mL）、提取溫度 62℃、超聲時(shí)間 30 min。此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)試驗(yàn)3次，銀杏葉多酚實(shí)際提取率為8.32%，與預(yù)測(cè)值（8.386%）接近，其相對(duì)誤差為0.79%。本試驗(yàn)銀杏葉多酚提取率遠(yuǎn)高于利用超聲輔助甲醇提取銀杏葉多酚得率6.34%[17]，以及機(jī)械力輔助提取銀杏葉多酚的得率7.33%[5]，但是低于酶解輔助乙醇提取法（12.71%）和微波輔助乙醇提取法（11.39%）的得率[8]。這可能和選取材料及多酚得率計(jì)算方法不同有關(guān)[24]。

2.3 銀杏葉多酚對(duì)羥自由基的清除作用

為了確定銀杏葉多酚的抗氧化能力，測(cè)定其對(duì)羥自由基（OH·）的清除作用，結(jié)果見圖6。

圖6 銀杏葉多酚對(duì)羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability of polyphenols extracted from Ginkgo biloba leaves

隨著濃度的增加，銀杏葉多酚和VC對(duì)羥自由基的清除率均逐漸增加。在相同濃度下，銀杏葉多酚對(duì)OH·的清除率高于VC，說明銀杏葉多酚具有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力與濃度正相關(guān)[25]。

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助乙醇提取銀杏葉多酚，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)影響銀杏葉多酚提取效果的因素進(jìn)行研究。結(jié)果表明，對(duì)銀杏葉多酚提取率的影響最大的是超聲時(shí)間及乙醇濃度，其次是提取溫度，料液比的影響相對(duì)較小，料液比和超聲時(shí)間對(duì)銀杏葉多酚提取率的交互影響顯著。銀杏葉多酚的最優(yōu)提取條件為，乙醇濃度74%、料液比1∶25（g/mL）、提取溫度 62 ℃、超聲時(shí)間 30 min，銀杏葉多酚提取率為8.32%。本研究采用的超聲輔助乙醇法可靠，適宜于在省時(shí)間、低耗能的條件下提取銀杏葉多酚。同時(shí)，在實(shí)際運(yùn)用該法提取多酚時(shí)要優(yōu)先考慮乙醇濃度和超聲時(shí)間，以及料液比和超聲時(shí)間的交互作用，以達(dá)到多酚的最大提取率。

植物多酚特有的成分決定了其具有很強(qiáng)的抗氧化性。在相同質(zhì)量濃度下，本試驗(yàn)提取的銀杏葉多酚對(duì)羥自由基的清除效果高于VC，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為一種羥基自由基的天然清除劑進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。但是，銀杏葉多酚較強(qiáng)的抗氧化性是由哪種具體成分發(fā)揮主要作用，以及其作用強(qiáng)度等有待于進(jìn)一步深入研究。因此，本研究為工業(yè)化生產(chǎn)銀杏葉多酚提供技術(shù)參數(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)利用銀杏葉多酚以及尋找天然安全的抗氧化劑提供依據(jù)。